受体报告基因实验及其在维甲酸和维甲酸X受体干扰物监测中的应用

受体报告基因实验具有快速、经济、灵敏、方便等诸多优势,在高通量筛选类或抗雌雄激素等通过核受体起作用的环境内分泌干扰物方面得到了广泛的应用。环境中的维甲酸和维甲酸X受体干扰物如有机锡等有着类似的作用机制,研究者也开始采用受体报告基因实验的方法对该类污染物进行筛选与监测。本文综述了受体报告基因实验的技术方法,包括报告基因和宿主细胞的选择,并介绍了该方法在人工合成的维甲酸和维甲酸X受体干扰物筛选以及环境样品中该类污染监测中的应用。综述总结了应用受体报告基因实验检测环境内分泌干扰物研究中的不足并对该方法的未来发展进行了展望,希望为该方法在环境监测和评估中的应用提供新的思路。

雄激素受体(hAR)CAT报告基因筛选AR激动剂和拮抗剂的方法研究

[目的]建立雄激素受体(hAR)报告基因实验,为AR激动剂和拮抗剂活性筛选提供检测方法。[方法]构建受雄激素效应元件(ARE)调控的氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因质粒pMMTV-CAT,将该质粒与hAR表达质粒AR/pcDNA3.1和阳性对照质粒pSV-β-Gal共转染非洲猴肾细胞株CV-1。以AR激动剂5α-双氢睾酮(5α-DHT)、糖皮质激素受体(GR)激动剂地塞米松和AR拮抗剂氟鲁他明为受试物,研究它们对AR的激动或拮抗作用。[结果]10^(-9)mol/L的5α-DHT显著诱导CAT的表达,诱导倍数为56.67,10^(-8)mol/L时达最大值,诱导倍数为79.30,在10^(-8)mol/L～10^(-6)mol/L范围内CAT的表达量维持在较高的平台水平。地塞米松不诱导CAT的表达。氟鲁他明在10^(-7)mol/L～10^(-5)mol/L浓度范围内显著拮抗1nmol/L的5α-DHT诱导的CAT的表达。[结论]5α-DHT对CAT的诱导和氰鲁他明对CAT的拮抗呈剂量-效应关系。该方法不存在与GR激动剂的交叉反应,具有较高的特异性。雄激素受体报告基因实验可以作为化学物(抗)雄激素活性筛选的方法。

甲状腺激素受体介导的荧光素酶报告基因试验筛查内分泌干扰化学物

目的采用人源性甲状腺激素受体(TRα/β)的荧光素酶报告基因试验系统筛查内分泌干扰化学物(EDCs),评估双酚A(BPA)、甲萘威和1-萘酚(1-NAP)的拟/抗甲状腺激素活性。方法以恒河猴肾细胞(LLCMK2)作为转染细胞,通过瞬时转染的方法分别构建基于pGL3-promega和pGL4.27的TRα/β的报告基因试验。用三碘甲状腺氨酸(T3)、甲状腺氨酸(T4)作为阳性受试物评价两个检测系统的灵敏性,并检测BPA、甲萘威和1-NAP的拟/抗甲状腺激素活性。结果基于pGL3-promega的TRβ的报告基因试验,T3的最低检测限为1.216×10^(-11) mol/L,在7.482×10^(-6) mol/L时诱导荧光素酶(Luc)的表达倍数是对照组的5.98倍,半数有效浓度(EC_(50))为3.327×10^(-8) mol/L;T4最低检测限为1.622×10^(-8) mol/L,最大诱导Luc表达的倍数为3.4倍,EC_(50)为2.213×10^(-7) mol/L。基于pGL4.27的TRβ的报告基因试验中,T3的最低检测限为9.863×10-12 mol/L,在1.671×10^(-6) mol/L时产生最大诱导Luc表达的倍数为对照组的8.57倍,EC_(50)为3.327×10^(-8) mol/L;T4最低检测限为1.349×10^(-9) mol/L,最大诱导Luc表达的倍数是4.6倍,EC_(50)为4.074×10^(-7) mol/L。用TRβ的报告基因试验系统评价BPA、甲萘威和1-NAP都无甲状腺受体激动剂活性,甲萘威和1-NAP有一定受体拮抗性。结论本研究建立的基于pGL3-promega和pGL4.27的TRβ的报告基因试验都有较高的灵敏性,pGL4.27相对更高,可以用来筛查内分泌干扰化学物,检测化学物质的拟/抗甲状腺激素活性。

沿海三市饮用水源水内分泌干扰毒性研究

近十多年来,江苏沿海化工产业发展迅速,化工废水的长期排放对水生生态系统及人群健康构成潜在威胁。采用非洲猴肾细胞(CV-1)核受体介导的体外转录激活试验方法,对中国东部沿海A、B、C三市的6个水源地进行了拟雌激素活性调查研究。结果表明:C市2处水源水的有机提取物在枯水期、平水期和丰水期均无拟雌激素活性检出,水质较好;A市的水源水提取物在枯水期具有明显的拟雌激素活性;B市的3处水源水有机提取物在3个季节均表现出显著的拟雌激素活性;雌激素活性当量计算结果表明,点位B-3在枯水期的当量浓度高于毒性限值,对水生生物的内分泌系统易造成威胁,应引起有关部门关注。另外,研究结果显示,CV-1细胞受体转录激活试验是一种筛选和分析环境样品的具有拟雌激素活性的快速和有效的方法,值得进一步推广和应用。