糖基化修饰对新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区(Spike RBD)与受体ACE2结合影响的非变性质谱研究

新型冠状病毒肺炎(新冠)疫情给人类生命安全和社会发展带来巨大威胁。新冠病毒表面的刺突(spike)蛋白受体结合区域(RBD)和宿主细胞膜表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合是病毒入侵的关键步骤。表征RBD和ACE2结合时的结构基础和动态变化有利于理解病毒入侵的机制,为药物研发提供思路。结构质谱是蛋白质结构表征中广泛应用的方法,本工作通过非变性质谱(native MS)研究糖蛋白RBD和ACE2样品及其复合物。首先,优化了使用PNGase F切除RBD N-糖时的条件,对切糖后RBD蛋白的异质性进行分析,并进一步考察了切糖前后RBD与ACE2形成蛋白复合物的稳定性。结果表明,RBD N-糖的切除会导致其与ACE2形成的复合物稳定性降低。本工作可为RBD的N-糖基化作用分析提供参考,并为后续实验RBD是否需要切N-糖处理提供指导建议。

绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白基因重组与鉴定

为了获得高表达量重组绿脓杆菌外毒素 A(PEA)受体结合区蛋白 ,以用作免疫原 ,从含有目的片段 (10 0 0 bp)的 p ET- 2 0 (b) +B1 0 质粒切下目的片段 ,以正确阅读框架插入含有 T7lac启动子的 p ET- 2 8c(+) DNA中 ,构建了p ET- 2 8c(+) B1 0 质粒。用该质粒转化大肠杆菌 BL2 1 (DE3 )、BL2 1 (DE3 ) p L y S,经 IPTG诱导 ,BL2 1 (DE3 ) p L y S能高效表达目的蛋白。 SDS- PAGE、Western blot分析证实 ,该蛋白即是所需的蛋白 ,该重组蛋白占菌体总蛋白的 5 8%。

艰难梭菌A毒素受体结合区基因在乳链菌中的表达

目的:在乳链菌内表达艰难梭菌A毒素受体结合区并检测其活性.方法:提取艰难梭菌标准株基因组DNA,扩增编码艰难梭菌毒素A毒素受体结合区的羧基未端基因重复序列(14CDTA),分别连接到乳链菌表达载体pNBC1000及pNBC2000,转化乳链菌,蛋白电泳及Western-blot检测蛋白定位表达情况.结果:成功构建了14CDTA乳链菌表达载体,并在乳链菌内表达了艰难梭菌受体结合区蛋白,分泌表达的艰难梭菌受体结合区蛋白大小约39.2 ku,膜锚定表达的受体结合区蛋白大小约为55.1 ku,所表达的蛋白均可与艰难梭菌A毒素多克隆抗体发生免疫印迹反应.结论:表达艰难梭菌受体结合区蛋白的重组乳链菌可以识别艰难梭菌A毒素多克隆抗体,为研制防治艰难梭菌疫苗的口服生态活菌亚单位疫苗奠定了一定基础.

兔出血症病毒衣壳蛋白P区二聚体的表达及其与受体结合能力分析

为检测兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)P区形成二聚体的能力及其与HBGAs受体结合的能力,作者以pMD19T-VP60为模板扩增包含铰链区H的P区基因(HP)并克隆至原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,获得HP蛋白。经SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示,HP蛋白主要以包涵体的形式高效表达,经HisTrap亲和柱纯化后可形成二聚体结构。通过HBGAs受体结合试验表明,P区与完整病毒衣壳相似,能与唾液中的HBGAs受体发生结合。本研究为进一步开展RHDV衣壳蛋白与受体的相互作用研究奠定基础。

酵母呈现SARS冠状病毒S蛋白受体结合区及其鉴定

目的获得能在酵母表面正确折叠的SARS病毒S蛋白的受体结合区。方法通过PCR技术从pVAX1/S质粒扩增出编码S蛋白318至520氨基酸残基的cDNA,酶切后克隆到酵母表面呈现载体pYD1,构建pYD1-RBD重组质粒,转化酵母细胞,流式细胞仪检测所呈现的RBD片段。结果通过流式细胞仪检测到酵母细胞表面有RBD片段的表达,并且此表面呈现的RBD片段与针对RBD不同表位的2株单抗均能结合,SARS病毒免疫的小鼠血清抗体也能与该片段结合。结论酵母表面呈现的RBD保持了天然RBD分子的构象,为基于RBD的药物筛选和疫苗设计提供物质基础。

重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白动物免疫保护试验

将绿脓杆菌外毒素 A( PEA)受体结合区基因重组质粒 p ET-2 8( c) +B1 0 转入大肠杆菌 BL2 1 ( DE3)plys,诱导表达出的重组 PEA受体结合区蛋白包涵体经脲素洗涤后 ,Sephacryl-2 0 0分子筛层析 ,DEAE-Sepharose FF离子交换层析获得纯度为 95.8%重组蛋白包涵体。将该蛋白作免疫原免疫小鼠后 ,用 PEA进行不同时间攻毒 ,观察到最佳保护时间为 1 4 d左右 ;

缺失激素结合区的人糖皮质激素受体突变体的研究

目的:构建缺失激素结合区(LBD)的人糖皮质激素受体突变体表达载体,并研究其表达和功能。方法:运用RT-nested PCR扩增人糖皮质激素受体(GR)基因不含编码LBD的cDNA序列,将PCR产物定向克隆至pEGFP-N2质粒载体,测序筛选编码正确的重组质粒;荧光显微镜观察GR突变体重组质粒转染人巨噬细胞株U937后的表达情况;相对荧光素酶法检测转染后细胞GR转录激活活性。结果:扩增出长1601 bp的cDNA序列,测序证实:克隆片段与Genebank该基因序列同源性为100%;重组质粒表达产物定位于细胞核;转染组细胞GR转录激活活性增强。结论:成功构建缺失LBD的GR突变体表达载体,该突变体具有不依赖激素的GR转录激活活性。

B型肉毒毒素受体结合区C片段在大肠杆菌中的表达及免疫原性研究

目的:在大肠杆菌中表达、纯化B型肉毒毒素受体结合区C片段(BHc-C),研究其免疫原性。方法:将BHc-C基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达GST-BHc-C融合蛋白并通过亲和纯化;以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备免疫血清,采用ELISA检测免疫血清的效价并测定其抗B型肉毒毒素中和活性。结果:在大肠杆菌中表达了GST-BHc-C融合蛋白;以该融合蛋白免疫小鼠获得高效价免疫血清,且该免疫血清具有中和活性。结论:获得了GST-BHc-C融合蛋白,并证实其具有免疫原性。

A型肉毒毒素受体结合区Hc在重组SFV复制子载体中的表达

为了在哺乳动物细胞中表达A型肉毒毒素Hc抗原,构建了含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的基于RNA和DNA的重组Semliki森林病毒(Semliki forest virus,SFV)复制子表达栽体。RNA和DNA复制子栽体转染BHK21细胞后,经间接免疫荧光、Western印迹和ELISA检测,结果表明非分泌型和分泌型的Hc抗原在细胞中都得到了有效地表达;而且复制子表达载体与辅助病毒载体共转染均可制备高滴度的重组病毒颗粒,该重组病毒颗粒感染细胞后,也都能表达Hc抗原。以上结果表明,基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体在细胞中均可有效地表达Hc抗原和制备具有感染能力并能表达Hc抗原的重组病毒颗粒。基于RNA和DNA的重组SFV复制子表达载体的构建和含A型肉毒毒素受体结合区Hc基因的重组病毒颗粒的获得,为进一步观察SFV复制子疫苗的免疫原性奠定了基础,从而为A型肉毒毒素新型疫苗的研制提供了新途经。

乳腺癌中雌激素受体DNA结合功能区的检测及意义

目的：发展检测雌激素受体（ＥＲ）ＤＮＡ结合功能区（ＤＢＤ）的方法，探讨其在内分泌治疗乳腺癌方面的临床意义．方法：根据ＥＲ特异地与雌激素应答元件（ＥＲＥ）相结合的原理，合成含有ＥＲＥ核心序列的ＤＮＡ片段，经３２Ｐ标记后作为探针．选取经激素结合法测定ＥＲ、ＰＲ（孕激素受体）同时阳性的１９例乳腺癌组织标本，制备乳腺癌组织和细胞株ＭＣＦ－７的蛋白抽提液．应用凝胶滞留法检测ＥＲＥ探针与抽提液中ＥＲ的结合能力作为反映ＥＲＤＢＤ功能的指标．结果：在制备的ＭＣＦ－７细胞蛋白抽提液中，放射自显影结果显示ＥＲ－ＥＲＥ复合物带（ＥＲ－ＥＲＥ＋），而在对照组结肠癌细胞中未出现此带（ＥＲ－ＥＲＥ－），应用竞争法发现此复合物带密度减弱．在１９例筛选的乳腺癌标本中，１３例ＥＲ－ＥＲＥ（＋），随访发现，１２例患者内分泌治疗效果好，３ａ内未见有复发转移灶；６例ＥＲ－ＥＲＥ（－），其中４例２ａ内出现肺部转移．结论：应用ＥＲＥ探针能直接检测ＥＲＤＢＤ功能，其检测结果可为临床乳腺癌患者内分泌治疗及其预后判断提供可靠依据．

SARS-CoV S蛋白受体结合区的重组表达及免疫原性分析

为了表达SARS-CoV的S蛋白的受体结合区并对其免疫原性进行分析,用PCR方法扩增S蛋白的受体结合区基因片段,克隆至原核表达质粒pET-32a+并在大肠杆菌中表达,应用Western-blot鉴定表达的目的蛋白,而后以该蛋白作为诊断抗原包被酶联板来检测20份SARS病人血清和28份健康人血清,结果原核表达的S蛋白能够和所用的SARS病人血清反应。这提示表达的S重组蛋白具有良好的抗原性。将变性纯化的重组蛋白和复性蛋白分别皮下免疫小鼠,第三次免疫一周后收集抗血清,用ELISA测定抗体和同时测定中和抗体活性。用变性的抗原免疫的小鼠血清均无中和活性;而用复性的蛋白免疫的小鼠产生了中和抗体。实验表明,S蛋白受体结合区无线性中和表位,中和抗体的产生是由构象表位诱导的。提示该蛋白有可能应用于亚单位疫苗的研究。

人雄激素受体的雄激素结合区cDNA在E.coli中的高效表达

将编码人雄激素受体 ( h AR)的雄素结合区 ( LBD)的 c DNA片段 ( 1 0 0 5 bp)克隆到由 P1 启动子控制的硫氧还蛋白表达载体p Trx Fus上 ,构建了表达质粒 p Trx AR,并转化到大肠杆菌 G1 72 4中。经色氨酸诱导表达后 ,SDS- PAGE分析 ,可观察到一高效表达的融合蛋白产物 ,此融合蛋白的分子量与理论值 ( 47KD)相吻合 ,氨基酸组分分析证明了L BD目的基因的表达。该融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白量的 5 0 %左右。尽管采用不同温度诱导 ,该融合蛋白均以不溶的包含体形式存在。应用分子筛技术 ,该融合蛋白在变性剂 (尿素 )存在下 ,可一步分离纯化。此研究结果为进一步进行 LBD的蛋白质复性研究、免疫分析提供了材料 ,也为蛋白质的高效表达提供了实验途径及体系。

VEGF受体KDR结合区的克隆与表达

ＫＤＲ 是血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ） 的主要受体之一， 它在介导ＶＥＧＦ 刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用． 为了获得人重组的有ＶＥＧＦ结合活性的ＫＤＲ， 通过ＲＴＰＣＲ 从人胎儿脐静脉内皮细胞（ＥＣ） 扩增出编码ＫＤＲ 胞外Ⅰ～Ⅳ区片段， 将其克隆在谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ） 融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ２Ｔ中， 并在大肠杆菌中获得稳定表达． 表达的融合蛋白ＧＳＴＫＤＲ 以包涵体形式存在， 其分子质量约６６ ｋｕ左右． 经碱变性法大量提取， 及制备胶电泳获得纯化的ＫＤＲ，

雌激素受体ERβ配体结合区的异源表达与纯化

为研究环境化合物与雌激素受体的相互作用,在大肠杆菌中异源表达了人雌激素受体ERβ的配体结合区(hERβ-LBD)蛋白。在诱导剂(IPTG)浓度为0.2mmol.L-1,培养温度25℃,诱导时间为8h的优化表达条件下,经亲和色谱法纯化后,hERβ(LBD蛋白的产量可达236mg.L-1.

1种胞外域仅含1个配体结合区的鸭催乳素受体基因的剪接异形体克隆及基因多态性分析

旨在了解鸭催乳素受体的作用,应用RACE技术克隆到了1种胞外域仅含1个配体结合区的剪接异形体。序列分析表明,剪接异形体长2 535bp,含431bp 5′-UTR、1 884bp编码区和220bp 3′-UTR,可划分为11个外显子。预测蛋白含627个氨基酸,成熟蛋白603个氨基酸,N端为24个氨基酸信号肽。不同于胞外域串联2个配体结合区的典型禽类催乳素受体,预测蛋白胞外域仅含1个配体结合区,类似于哺乳动物催乳素受体。配体结合区同样含有2对半胱氨酸残基和1个WSXWS的5肽WS基序,此为细胞因子受体超家族I型受体中高度保守的2个典型特征。同时,筛选了催乳素受体基因的1个突变位点和1个SNP位点,分别位于5′-及3′-UTR区。其中,3′-UTR区SNP位点经χ2适合性检验,在鸭群体中未达到Hardy-Weinberg平衡状态。

不同致惊药物对小鼠不同脑区^3H—GABA与GABAA受体结合的影响

用放射配体受体结合分析法，测定致惊药物红藻氨酸（ｋａｉｎｉｃ， Ｋ Ａ）和印防己毒素（ｐｉｃｒｏｔｏｘｉｎ， Ｐｉｃ）对小白鼠下丘脑、大脑皮层、海马、小脑四个脑区３ Ｈ Ｇ Ａ Ｂ Ａ 和 Ｇ Ａ Ｂ Ａ Ａ 受体结合的影响。结果显示， Ｋ Ａ、 Ｐｉｃ均能明显降低各脑区３ Ｈ Ｇ Ａ Ｂ Ａ和 Ｇ Ａ Ｂ Ａ Ａ 受体的结合量，除 Ｐｉｃ 对下丘脑无显著差异外，其余均有显著性差异（ Ｐ＜０．０５ 或 Ｐ＜ ０．０１）。实验结果提示： Ｋ Ａ 和 Ｐｉｃ均能降低 Ｇ Ａ Ｂ Ａ Ａ 受体的结合量，但是它们是通过不同的途径间接或直接地影响 Ｇ Ａ Ｂ Ａ

重组PEA受体结合区蛋白的免疫活性

为了观察重组绿脓杆菌外毒素 A(PEA)受体结合区蛋白在不同动物体内的免疫效果 ,将该蛋白纯化后免疫了小鼠、家兔、山羊等动物。对小鼠进行了攻毒实验 ,通过 EL ISA方法检测了家兔、山羊血清中抗体的消长规律。结果对小鼠的保护情况为 :最后 1次免疫后 14 d小鼠对 3倍 L D50 的 PEA攻毒保护率为 10 0 % ,2 1d保护率为 5 0 % ,2 8d后无保护效果。家兔和山羊免疫后 7～ 14 d达到峰值 ,2 1d后逐渐降低 ,2 8～ 35

人孕酮受体激素结合区基因表达产物的检测与制备

PuPR为含有编码人孕激素受体（hPR）激素结合区（LBD）基因（631-933氨基酸）的pUC19重建质拉，在其宿主Escherichiacoli（BL21）中，经1mmol/L的IPTG诱导，该转化的细菌产生一C端为6×His结尾的蛋白质，分子量45KD。该表达产物可利用Ni-NTAHRP在ng水平用Western印迹检测，并可通过亲和层析的方法，利用His－bindingresin（Ni树脂）从菌体的裂解液中方便地回收到该蛋白质。

重组含绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白的表达、纯化、复性及细胞生物学活性研究

绿脓杆菌是烧伤及外科手术感染的主要病原菌之一,而绿脓杆菌外毒素A(PEA)是该菌的最主要的毒力因子之一,极微量的PEA便可引起肝、肾等组织细胞死亡,进而导致肝、肾等多器官功能衰竭,这是临床上绿脓杆菌感染后高死亡率的主要原因。同时,PEA还严重影响创口的愈合。目前临床上对于绿脓杆菌感染的控制以及对PEA毒血症的防治尚无有效的方法与手段。

一种不依赖于活病毒的中东呼吸综合征冠状病毒受体结合区特异性中和抗体检测方法的建立

目的拟建立一种不依赖于活病毒和高等级生物安全条件,快速简便检测中东呼吸综合征冠状病毒(MERSCoV)受体结合区(RBD)特异性的中和抗体。方法利用哺乳动物表达系统表达重组rRBD-Fc蛋白;应用流式细胞术检测rRBD-Fc蛋白与Huh-7细胞结合的最佳浓度,建立通过流式细胞术检测rRBD-Fc与Huh-7结合活性的方法,并利用无关蛋白验证结合的特异性;在此基础上,利用RBD特异性中和抗体、RBD特异性非中和抗体、MERS-CoV RBD免疫小鼠血清和无关抗体建立能够检测中和抗体阻断RBD与Huh-7结合作用的RBD特异性中和抗体检测技术方法,并与实毒中和试验进行比较,评价方法的一致性;应用建立的中和抗体检测方法进行血清学检测。结果成功表达了rRBD-Fc蛋白,rRBD-Fc蛋白能够与Huh-7细胞特异性结合,并确定了rRBD-Fc与Huh-7细胞结合的最佳剂量;在此基础上建立了通过流式细胞术检测抗体阻断RBD与Huh-7结合作用的RBD特异性中和抗体检测技术方法,结果表明,检测方法能够区分具有中和活性的RBD特异性中和抗体、rRBD-Fc免疫小鼠血清和其他抗体,具有特异性,且能够反映中和活性的强弱。该方法在检测12株中和抗体时,与传统的实毒中和试验检测结果具有很好的一致性,能够有效应用于血清学检测。结论成功建立了一种不依赖活病毒和高等级生物安全条件,即可快速检测MERS-CoV RBD特异性中和抗体的方法,为针对MERS-CoV疫苗设计和抗体效果快速评价、血清学调查和免疫保护机制研究提供了一种更加简便、安全的技术手段。