糖基化修饰对新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区(Spike RBD)与受体ACE2结合影响的非变性质谱研究

新型冠状病毒肺炎(新冠)疫情给人类生命安全和社会发展带来巨大威胁。新冠病毒表面的刺突(spike)蛋白受体结合区域(RBD)和宿主细胞膜表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合是病毒入侵的关键步骤。表征RBD和ACE2结合时的结构基础和动态变化有利于理解病毒入侵的机制,为药物研发提供思路。结构质谱是蛋白质结构表征中广泛应用的方法,本工作通过非变性质谱(native MS)研究糖蛋白RBD和ACE2样品及其复合物。首先,优化了使用PNGase F切除RBD N-糖时的条件,对切糖后RBD蛋白的异质性进行分析,并进一步考察了切糖前后RBD与ACE2形成蛋白复合物的稳定性。结果表明,RBD N-糖的切除会导致其与ACE2形成的复合物稳定性降低。本工作可为RBD的N-糖基化作用分析提供参考,并为后续实验RBD是否需要切N-糖处理提供指导建议。

基于分子对接技术筛选新型冠状病毒变异体XBB.1.5 RBD抑制剂

目的利用虚拟筛选技术筛选出可抑制新冠病毒变异体XBB.1.5 S蛋白受体结合区域(RBD蛋白)与血管紧张素转化酶2(ACE2)结合的小分子抑制剂,从而阻断新冠病毒对宿主的识别。方法在Mcule小分子数据库中下载486387个配体小分子。使用Jarvis-Patrick聚类后采用AutoDock Vina软件进行基于质心的分子对接。结果确定了XBB.1.5 RBD蛋白与ACE2相互作用的关键氨基酸残基,深入分析了5个候选物小分子与XBB.1.5 RBD蛋白的结合模式,化合物1与XBB.1.5 RBD蛋白的TYR489和SER490残基形成π-π堆积和氢键相互作用;化合物2与TYR449、SER494和TYR501通过氢键和π-π堆积结合;化合物3主要与TYR451形成氢键;化合物4与TYR427通过π-π堆积结合;化合物5则与ARG381、GLN387和ASN395残基形成π-阳离子堆积和氢键。上述相互作用均干扰了XBB.1.5 RBD与ACE2的结合,起到抑制作用。通过ADMET模拟分析,预测了候选化合物的生物利用度、遗传毒性和致癌性,最终得到了潜在的抑制剂分子。结论从数据库中筛选出潜在的新型冠状病毒变异体XBB.1.5 RBD蛋白的小分子结构,进而阻断S蛋白与ACE2之间的结合,为抗新型冠状病毒药物研究及处方筛选提供参考。

新型冠状病毒受体结合结构域分子探针的构建及在中和抗体分离中的应用

目的构建新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)分子探针,对新型冠状病毒感染康复者(简称“新冠康复者”)的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)进行单克隆记忆B细胞分选,获得RBD特异性中和抗体。方法从GenBank中下载SARS-CoV-2 RBD序列,在C末端加入Avi标签和6组氨酸标签后进行密码子优化设计、合成基因后克隆入表达载体pDRVI1.0,转染293F表达出蛋白进行生物素化后,利用该探针从2名新冠康复者的PBMCs中分选出单克隆RBD特异性B细胞。对B细胞裂解后,进行抗体轻重链可变区扩增,将获得的抗体轻重链基因分别克隆入表达载体,转染293F细胞后采用Protein A对抗体进行纯化,并利用SARS-CoV-2假病毒对其中和能力进行测试。结果成功获得了RBD-Avi蛋白,RBD-Avi探针生物素化效率达到30%~50%,Western Blot实验证实生物素化探针可以被来自于新冠康复者血浆中的抗体所识别,利用该探针可从2名新冠康复者体内成功分别分离出7个、16个RBD特异性记忆B细胞,分别占总细胞群的0.24%和0.17%;对获得的B细胞进行裂解后扩增出抗体的轻重链可变区,分别获得了7对、12对抗体轻重链。2名新冠康复者体内共表达出16个抗体,纯化抗体后利用SARS-CoV-2假病毒进行测试,大部分抗体对假病毒都展示出了中和活性,其中6个抗体的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)低于1μg/mL;XJ-A9和SCF-F1针对野生型假病毒的IC50值分别达到0.07μg/mL和0.35μg/mL。结论本研究构建的SARS-CoV-2 RBD分子探针具有良好的抗原性,分离的抗体具有针对SARS-CoV-2野生型假病毒的中和活性,具备深入研究的价值。

抗新型冠状病毒中和抗体研究现状及展望

中和抗体是一种卓越的抗病毒“特效药”,在对抗新型冠状病毒肺炎疫情中被寄予厚望,然而新冠病毒变异株不断出现,完全或者部分逃逸了中和抗体,显著降低了中和抗体的抗病毒作用。本文综述了当前新冠中和抗体的研发现状,重点阐明了这些抗体的作用靶点、机制以及分类特征等;并在新冠病毒变异株全球大流行的背景下,探讨中和抗体面临的严峻挑战和未来可能的发展方向,旨在为研发更加广谱中和抗体对抗病毒突变提供重要思路。