新型冠状病毒疫苗受体结合域抗原含量检测方法建立

目的建立通用的新型冠状病毒疫苗(简称新冠疫苗)受体结合域(RBD)抗原含量检测方法。方法以新冠病毒刺突蛋白(S蛋白)RBD的重组抗体为标准品,先将疫苗中的蛋白解吸附,采用酶联免疫吸附试验检测疫苗中的RBD蛋白含量,并验证方法的线性、定量下限、准确度、精密度和稀释可靠性,同时对部分上市新冠疫苗进行检测。结果3次试验标准曲线的决定系数(R2)分别为0.9966,0.9958,0.9975(n=6);定量下限为7.81 pg/mL;批内和批间准确度均值为质控标示值的91.98%~110.16%(精密度试验)和93.68%~101.01%(稀释可靠性试验),X,Y,Z公司的加样回收率分别为86.81%,82.97%,105.41%,测定值的变异系数均小于10%。X,Y,Z公司新冠疫苗中RBD蛋白的平均含量分别为302.96 pg/mL、1010.80 pg/mL、42.92μg/mL。结论该方法的方法学验证指标均符合2020年版《中国药典(四部)》通则9012指导原则相关要求,可用于多种技术路线新冠疫苗的RBD抗原含量检测。

猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合域的分析

以猪流行性腹泻病毒(PEDV)可溶性的猪氨基肽酶N受体为靶蛋白对PEDV S1基因特异性肽库进行3轮生物淘选,然后对30个淘选的噬菌体克隆进行测序。序列分析发现,2个噬菌体克隆展示无义氨基酸序列,其余28个噬菌体克隆展示的氨基酸序列位于PEDV S蛋白的第249-529位氨基酸区域,这个区域被命名为MRR。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对MRR基因进行真核表达。Western blot结果表明,表达的MRR重组蛋白能够与兔抗PEDV多克隆抗体反应。

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体的制备和特性分析

目的:表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域β6LBD,并制备兔抗β6LBD多克隆抗体。方法:利用PCR方法扩增整联蛋白β6LBD基因片段,经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连入pGEX-4T-1原核表达载体,构建的pGEX-4T-1-β6LBD重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体,纯化目的蛋白。然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA方法测定抗体效价,并以Western blot鉴定其特异性。结果:SDS-PAGE电泳分析显示pGEX-4T-1-β6LBD诱导后表达一Mr约为42000的GST-β6LBD融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,用纯化GST-β6LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性。结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗猪源整联蛋白β6LBD多克隆抗体,为深入研究整联蛋白β6在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础。

F18大肠杆菌黏附素受体结合域鉴定新方法

运用DNA重组技术将F18ab和F18ac大肠杆菌黏附素fedF亚单位内的第60～109位氨基酸残基区段(fedF1)和fedF全基因克隆入V型分泌系统MisL的载客结构域上,经DNA测序确证其正确阅读框后,含重组菌质粒pnirBMisL-fedF或pnirBMisL-fedF1经厌氧诱导后,与断奶仔猪小肠上皮细胞进行体外黏附试验。结果表明:FUT1基因M307位点中GG型和AG型仔猪小肠上皮细胞均能黏附上述重组菌,而AA型个体小肠上皮细胞则不能黏附。上述重组菌均能与兔抗F18ab菌毛FedF亚单位单因子高免血清发生玻板凝集反应。而FedF突变体FedF(M)的重组质粒菌则失去上述凝集和黏附特性。证明F18大肠杆菌黏附素fedF基因及其基因片段fedF1在大肠杆菌表面得到了功能性表达,F18ab和F18ac黏附素FedF直接介导F18大肠杆菌与易感仔猪小肠上皮细胞表面大分子受体黏附结合,fedF1为黏附素FedF的受体主要结合域,其His88、His99是FedF黏附素受体结合域的重要氨基酸残基。

ghrelin对脓毒血症大鼠肺脏炎症及核苷酸结合寡聚域2和受体相互作用蛋白2 mRNA表达的影响

目的研究ghrelin对脓毒血症大鼠肺脏中性粒细胞浸润、炎性细胞因子[肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6]及核苷酸结合寡聚域2(NOD2)和受体相互作用蛋白2(RIP2)mRNA表达的影响。方法 24只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为4组:假手术组(Sham组)、假手术+ghrelin组(Sham+ghrelin组)、脓毒血症组(CLP组)和脓毒血症+ghrelin组(CLP+ghrelin组)。采用盲肠结扎穿孔(CLP)的方法建立脓毒血症大鼠模型。Sham+ghrelin组和CLP+ghrelin组分别于假手术或CLP后即刻经尾静脉注射10 nmol/kgghrelin,Sham组和CLP组于相应时间点尾静脉注射等量0.9%氯化钠溶液,给药速率为0.2 mL/min。于假手术或CLP后6 h麻醉下处死大鼠,取肺组织,光学显微镜下观察肺组织病理学变化,并测定髓过氧化物酶(MPO)活性、TNF-α和IL-6水平以及NOD2和RIP2 mRNA的表达。结果与Sham组和Sham+ghrelin组比较,CLP组和CLP+ghrelin组肺组织MPO活性、TNF-α和IL-6水平、NOD2和RIP2 mRNA的表达均显著升高(P值均<0.05);CLP+ghrelin组肺组织MPO活性、TNFα-和IL-6水平、NOD2和RIP2 mRNA的表达均显著低于CLP组(P值均<0.05)。结论 ghrelin可改善脓毒血症大鼠肺脏中性粒细胞的浸润、下调肺组织炎性细胞因子(TNF-α和IL-6)的表达,其作用可能与抑制NOD2/RIP2信号通路有关。

牛口蹄疫病毒受体通用亚基αv配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

目的:利用原核细胞表达牛口蹄疫病毒受体通用亚基整联蛋白αv的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法:以含有牛整联蛋白全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到位于αv成熟肽氨基端的LBD基因片段,经酶切消化处理后,与同样酶切处理的原核表达载体pPRoEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRo/αvLBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达αvLBD蛋白。通过SDS-PAGE鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性。结果:成功构建了pPRo/αvLBD原核表达载体,实现了重组αvLBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其Mr约为40000,主要以包涵体形式存在于菌体中。制备的兔多克隆抗体效价达1∶25600以上。以Western blot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性。结论:实现了牛口蹄疫病毒受体通用亚基αvLBD的高效表达和高效价多克隆抗体的制备,为深入研究整联蛋白αv在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础。

核受体结合域蛋白2的研究进展

核受体结合域蛋白2（NSD2）是含有SET结构域的一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶，它是NSD蛋白家族（NSD1、NSD2和SD3）的成员之一，

传染性支气管炎病毒受体及其纤突蛋白受体结合域研究进展

传染性支气管炎(IB)是一种由冠状病毒科γ属传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种高度接触性传染病,有多个临床致病型。位于冠状病毒囊膜上的纤突蛋白(S)是病毒组织嗜性和致病性的主要决定因素,S1蛋白上受体结合域(RBD)与宿主细胞受体的结合是病毒感染的第一步,α和β属多种冠状病毒纤突蛋白(S)与宿主受体相互作用机制已研究得比较清楚,目前IBV受体及受体结合域是研究的热点。论文就近几年来IBV S蛋白的受体结合域、受体多样性、S1蛋白变异对RBD的影响及S2蛋白对IBV细胞嗜性的影响等方面研究进展进行综述,以期为揭示其致病机制,研制更有效的疫苗、抗病毒药物及诊断制剂等提供参考。

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体的制备

以纯化的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域重组蛋白为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,制备口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体(McAb);采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,并用SDS-PAGE、间接ELISA以及间接免疫荧光法对制备的McAb的特异性进行鉴定。结果显示,成功获得5株能稳定传代并分泌抗β6亚基配体结合域的杂交瘤细胞株,分别命名为C4C7、E7C7、B8C9、C2D8和B7B6,其分泌的McAb为IgG2b(C2D8)和IgG2a(C4C7、E7C7、B8C9、B7B6)亚类。制备的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域McAb可为深入研究整联蛋白αvβ6在口蹄疫病毒感染过程中的作用奠定基础。

2型糖尿病患者胰岛素受体胰岛素结合域基因突变的研究

目的:研究胰岛素受体结合域基因突变与胰岛素受体(INSR)功能异常的关系。方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析法和核酸银染法,对70例2型糖尿病患者INSR结合域基因第2,3,6三个外显子(exon)及部分相邻内含子进行基因突变检测。结果:在对外显子6的检测中发现有9例突变,突变又可分为B,C两种不同的SSCP带型。其中B型7例,C型2例,C型突变经测序结果,与外显子6的3′端毗邻的内含子的第43位A→C突变。在外显子3中发现了2例突变,为同一带型。在外显子2中尚未发现突变带型。结论:INSR结合域基因的突变在2型糖尿病中出现的频率较低。C型突变对INSR结合域的影响及其在2型糖尿病发病中的作用尚待进一步研究。

口蹄疫病毒受体羊源整联蛋白β6亚基配体结合域的原核表达、纯化及鉴定

利用原核细胞表达羊口蹄疫病毒(FMDV)受体整联蛋白β6亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白。以含有羊整联蛋白β6亚基全长cDNA的质粒为模板,PCR扩增得到β6LBD基因片段,经酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pPROEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRO/β6LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达重组羊β6LBD融合蛋白。SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达并利用镍离子亲和树脂对其纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot方法分析鉴定表达产物。成功构建了pPRO/β6LBD原核表达载体,实现了羊FMDV受体整联蛋白亚基β6LBD在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为33 kDa,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。用本试验室保存的抗FMDV受体猪源整联蛋白β6亚基LBD的单克隆抗体进行ELISA和Western blot检测,显示该单抗可与重组目的蛋白发生特异性反应,证明纯化后的蛋白与特异性抗体具有良好的特异性反应及抗原活性。为深入研究整联蛋白受体β6亚基在羊体内的分布及其在FMDV致病过程中的作用机制奠定了基础。

猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.

糖皮质激素受体结合域诱饵表达载体的构建及鉴定

目的构建糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)结合域的诱饵表达载体。方法RT-PCR扩增GR结合域,克隆入pMD18-T,测序正确后,再亚克隆入诱饵载体pGBKT7中,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-GR转化到酵母AH109细胞中,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用。结果成功扩增了GR结合域,并分别成功克隆到pMD18-T和pGBKT7中,测序结果正确。诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Western blot分析结果也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白。结论成功构建了GR结合域的酵母诱饵表达载体。

SARS冠状病毒受体结合域在大肠杆菌中的融合表达和鉴定

目的为了研究SARS冠状病毒感染与免疫和跨种属传播机制,从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒Spike蛋白基因中,克隆病毒受体结合域(receptor binding domain,RBD)基因片段,在大肠杆菌中进行表达。方法用PCR方法扩增RBD基因,先经T-A连接,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆测序鉴定,双酶切后进一步亚克隆至质粒pGEX-6p-3,构建原核表达重组质粒,通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达,并用SDS-PAGE和Western-blotting方法检测表达情况。结果扩增了RBD的编码基因并成功构建了其原核表达载体pGEX-6p-3-hsRBD和pGEX-6p-3-csRBD,RBD能够在大肠杆菌中获得良好的表达,表达的融合蛋白相对分子质量约为47000。结论本工作利用基因工程技术表达了两物种来源的SARS冠状病毒的RBD,两者具有高度的同源性,因此我们可通过配基受体结合实验,为进一步研究SARS冠状病毒感染与免疫及跨种属传播机制奠定了基础。

SARS冠状病毒spike蛋白上的CoV的受体结合域的研究进展

严重急性呼吸综合征(SARS)是由一种新发现的动物源性SARS冠状病毒(SARS coronavirus)引起,具有高致病性、高传染性和高病死率的新型人类疾病。现已鉴定SARS-CoV的刺突糖蛋白上的受体结合域(RBD)介导了病毒与靶细胞的相互作用,在跨种属传播起了十分重要的作用。现综述RBD的组成、功能和应用等方面的研究进展。

SARS冠状病毒S蛋白受体结合域的克隆测序

目的从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒S蛋白基因中,获得受体结合域(RBD)基因的克隆。方法用PCR方法扩增RBD基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定,并分析RBD基因序列。结果获得了人和果子狸来源的RBD的基因片段,长度为579 bp,两者具有高度的同源性。结果RBD是SARS冠状病毒与靶细胞结合的部位,本工作成功克隆了SARS冠状病毒的RBD基因,为该基因的表达和功能研究奠定了基础。

重组腺病毒过表达Notch1受体胞内结合域(NICD1)外源性激活Notch信号通路

目的:构建Notch1受体胞内结合域(Notch1 intracellular domain,NICD1)的重组腺病毒AdNICD1,探讨外源性过表达AdNICD1对Notch信号通路激活的影响。方法:利用高保真PCR(high fidelity PCR,Hi-Fi PCR)扩增NICD1编码区,并通过Gibson Assembly方法将其克隆至腺病毒载体中,经过菌落PCR、测序鉴定后,在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,再次通过质粒PCR鉴定,然后运用PacⅠ酶切线性化后用重组腺病毒载体转染过表达pTP基因的人胚肾293细胞(human embryo kidney 293 cell line,HEK293)中进行包装,收取病毒后使用过表达pTP基因的HEK293细胞扩增重组腺病毒AdNICD1。运用AdNICD1感染脂肪来源的间充质干细胞(immortalized multipotent adipose-derived mesenchymal stem cells,iMAD),检测病毒感染效率;通过Q-PCR检测NICD1和Notch下游基因表达情况;利用Westernblot检测NICD1在蛋白水平的表达情况。结果:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒并有效感染iMAD;利用AdNICD1可明显增加NICD1在基因和蛋白水平的表达,并激活Notch信号下游基因的表达。结论:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒,并有效激活Notch信号通路。

基于毕赤酵母制备的SARS-CoV2RBD-重组蛋白疫苗的免疫方案优化及不同佐剂对中和抗体滴度的影响

目的对基于毕赤酵母制备的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)RBD重组蛋白疫苗的免疫方案进行优化并考察不同佐剂对中和抗体(NAb)滴度的影响,为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供参考。方法将RBD基因片段亚克隆至pPICZαA质粒,质粒经线性化转化后整合到毕赤酵母基因组中进行重组表达,将获得的重组蛋白疫苗联合不同的佐剂对小鼠进行免疫以评估其免疫原性。结果目标蛋白wtRBD和Delta RBD均能通过毕赤酵母系统获得满意过表达;与42 d间隔时间相比,28 d间隔时间的IgG抗体滴度增加了1.8倍(44923 vs.80507);间隔28 d的3剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度比间隔42 d高2.5倍(2191 vs.891);Delta RBD重组蛋白疫苗联合铝佐剂免疫后,针对Delta变体的NAb几何平均滴度达到了32255(2167~88084);在采用5μg或30μg Delta RBD免疫情况下,铝佐剂+CpG佐剂组的NAb滴度均为单独采用铝佐剂组的10倍左右;第3次免疫后,5μg抗原组与30μg抗原组中Delta RBD特异性IgG滴度差异无统计学意义(P>0.05)。结论基于毕赤酵母制备的wtRBD或Delta RBD都可以用作有效的抗原,间隔28 d的3剂疫苗给药最有效,Delta RBD重组蛋白与铝佐剂+CpG佐剂的联合免疫能够获得更高滴度的NAb以对SARS-CoV-2及其变体发挥免疫作用,可为SARS-CoV-2疫苗的持续优化研究提供一定参考。

糖基化修饰对新型冠状病毒刺突蛋白受体结合区(Spike RBD)与受体ACE2结合影响的非变性质谱研究

新型冠状病毒肺炎(新冠)疫情给人类生命安全和社会发展带来巨大威胁。新冠病毒表面的刺突(spike)蛋白受体结合区域(RBD)和宿主细胞膜表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合是病毒入侵的关键步骤。表征RBD和ACE2结合时的结构基础和动态变化有利于理解病毒入侵的机制,为药物研发提供思路。结构质谱是蛋白质结构表征中广泛应用的方法,本工作通过非变性质谱(native MS)研究糖蛋白RBD和ACE2样品及其复合物。首先,优化了使用PNGase F切除RBD N-糖时的条件,对切糖后RBD蛋白的异质性进行分析,并进一步考察了切糖前后RBD与ACE2形成蛋白复合物的稳定性。结果表明,RBD N-糖的切除会导致其与ACE2形成的复合物稳定性降低。本工作可为RBD的N-糖基化作用分析提供参考,并为后续实验RBD是否需要切N-糖处理提供指导建议。