张岩/毛春友教授团队揭示蛋白酶激活受体的栓配体结合和激活机制及G蛋白选择性的结构基础

2024年7月12日,浙江大学基础医学院张岩/毛春友教授团队联合上海药物研究所徐华强团队在《细胞研究》(Cell Research)上发表了题为“Structural basis of tethered agonism and G protein coupling of protease-activated receptor”的研究论文(DOI:10.1038/s41422-024-00997-2),报道了人源PAR1独特的栓配体结合激活机制和G蛋白选择性机制,为开发新型靶向蛋白酶激活受体(PAR)1的G蛋白选择性药物提供了结构基础。

川芎嗪对VEGF受体与其放射性配体结合的抑制

目的探讨川芎嗪对VEGF受体与其放射性配体结合的影响。方法采用血清药理学方法,分别制备川芎嗪大剂量、小剂量、阳性对照组鱼精蛋白、生理盐水各组含药血清,采用反相高效液相色谱法测定川芎嗪含药血清中药物浓度。将各组血清作用于人脐静脉内皮细胞ECV304,采用放射配体受体结合分析法(RBA)观察川芎嗪对VEGF受体最大结合容量(Bmax)和解离常数(Kd值)的影响。结果川芎嗪大剂量组Kd=343.30±36.64pmol·L-1,Bmax=46.26±5.85fmol/2×105cells,与生理盐水组相比Kd增大(P<0.05),Bmax减小(P<0.05)。川芎嗪小剂量组与生理盐水组相比Kd有增大趋势、Bmax有减小趋势,但差异无显著性。阳性对照组Kd=179.07±25.65pmol·L-1,受体最大结合容量Bmax=38.65±9.83fmol/2×105cells,与生理盐水组相比Kd差异无显著性(P>0.05),Bmax减小(P<0.05)。结论在川芎嗪作用下VEGF受体与125IVEGF结合的亲和力下降,VEGF受体数目下降,川芎嗪抑制VEGF受体与125IVEGF结合。川芎嗪含药血清(143.0mg·kg-1组)抑制VEGF受体与125IVEGF结合。

基于受体配体结合技术研究酸枣仁镇静催眠活性成分

目的利用受体配体结合法探索酸枣仁中镇静催眠的活性成分,以及该成分的镇静催眠作用机制与苯二氮卓受体的关系。方法首先,对酸枣仁中的化学成分进行乙醇粗提;其次,制备Wistar大鼠脑组织匀浆液;根据受体-配体结合原理,采用体外饱和分子竞争的方法,利用高浓度的地西泮作为阳性竞争药,竞争低浓度的酸枣仁中可与脑组织中苯二氮卓受体结合的配体化合物;收集这些镇静催眠有效化合物,利用HPLC和LC-MS方法对酸枣仁与脑组织孵育提取化合物、地西泮与脑组织孵育提取化合物、地西泮+酸枣仁与脑组织孵育提取化合物进行谱图表征差异性分析鉴定,以确认被地西泮竞争置换出的酸枣仁中的有效镇静催眠化合物。结果 HPLC检测结果显示,与地西泮组、酸枣仁+地西泮组对比,酸枣仁作用组在出峰时间2.71min和46.87min处出现特殊峰。LC-MS检测结果表明,酸枣仁中与苯二氮卓受体结合的配体化合物分别为274.28 m/z、453.34 m/z、496.34 m/z和608.38 m/z,根据酸枣仁指纹图谱的比对这些化合物可能是脂肪酸类物质和三萜类化合物。结论利用受体配体结合技术的原理,结合HPLC和HPLC-MS分析技术研究酸枣仁中镇静催眠活性成分,实验结果发现,酸枣仁中镇静催眠的活性成分可能是脂肪酸类物质棕榈酸(palmitic acid,C_(16)H_(32)O_2)、三萜类化合物麦珠子酸(alphitolic acid,C_(30)H_(48)O_4)和斯皮诺素(spinosin,C_(28)H_(32)O_(15)),这3种化合物由于与地西泮竞争结合苯二氮卓受体,可能具有类似的镇静催眠作用,这为进一步开发新型镇静催眠药奠定了理论基础。

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体的制备和特性分析

目的:表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域β6LBD,并制备兔抗β6LBD多克隆抗体。方法:利用PCR方法扩增整联蛋白β6LBD基因片段,经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连入pGEX-4T-1原核表达载体,构建的pGEX-4T-1-β6LBD重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体,纯化目的蛋白。然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA方法测定抗体效价,并以Western blot鉴定其特异性。结果:SDS-PAGE电泳分析显示pGEX-4T-1-β6LBD诱导后表达一Mr约为42000的GST-β6LBD融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,用纯化GST-β6LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性。结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗猪源整联蛋白β6LBD多克隆抗体,为深入研究整联蛋白β6在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础。

大鼠中枢5-HT_(1A)受体的结合容量与高血压

目的 :探讨 5 - HT1 A受体结合容量改变对高血压发病的影响。方法 :通过放射性配体与受体结合实验 ,探讨不同周龄自发性高血压大鼠 (SHR)和对照组 Wistar- Kyoto (WKY)大鼠在脑区不同部位 5 - HT1 A受体的结合特征。 结果 :SHR不同脑区脑组织膜的 Bmax随着大鼠周龄的增加而增大 ,且有显著差异 ;WKY鼠差异不明显。相同脑区不同周龄 SHR的 Bmax均大于WKY大鼠 ,且随着周龄的增加血压呈上升趋势 ,其 5 - HT1 A受体的 Bmax与血压成正比 ,WKY无此现象。 4～ 5周龄的 SHR为高血压未形成期 ,10～ 12及以上周龄的 SHR处于高血压的形成期。结论 :当血压发生变化时 ,中枢 5 - HT1 A受体结合容量发生继发性改变。不同脑区中枢 5 - HT1

补中益气汤药物血清对脾虚大鼠离体胃壁细胞胃泌素受体结合容量的影响

目的观察补中益气汤等药物血清对离体脾虚大鼠胃壁细胞胃泌素受体结合容量的影响。方法放射配基受体结合测定方法。结果脾虚大鼠胃泌素受体结合容量减少,经补中益气汤含药血清作用后结合位点数上升。结论补中益气汤药物血清对脾虚大鼠的结合位点数下降具有上调作用。

新多肽配体GE11与表皮生长因子受体的结合能力分析

应用亲和毛细管电泳(ACE)分析方法,对表皮生长因子受体(EGFR)和新多肽配体GE11之间的结合能力进行分析。结果表明,EGFR与多肽配体GE11之间存在特异性相互作用,考察EGFR在不同浓度GE11溶液中的迁移情况,采用非线性、双倒数、Y-倒数和X-倒数4个数据处理方法得到较好的数据拟合,并测得结合常数。该文为筛选多肽配体以及测定受体与多肽配体之间的结合常数提供了简便的方法,将有力推动肿瘤靶向药物输送的研究。

经前期综合征肝气郁证大鼠下丘脑ERβ的表达及配体受体结合活性的研究

目的探讨经前期综合征(PMS)肝气郁证发病的微观分子机理和中药经前舒颗粒对PMS肝气郁证的干预机制。方法雌性SD大鼠随机分为3组:正常对照组、模型组和经前舒组。慢性束缚应激法复制PMS肝气郁证大鼠模型,以经前舒颗粒进行药物干预。放射性配体受体结合技术测定下丘脑中雌激素受体β亚型(ERβ)的结合活性变化;Western blot技术检测下丘脑中ERβ蛋白的表达。结果与正常对照组比较,PMS肝气郁证模型组大鼠下丘脑中ERβ的配体受体结合活性、蛋白表达显著升高(P<0.05),而经前舒组可纠正其异常升高。结论下丘脑中ERβ表达量、配体受体结合活性的升高可能是导致PMS肝气郁证的重要病因;经前舒颗粒对下丘脑中ERβ表达、配体受体结合活性的异常变化有纠正作用。

牛口蹄疫病毒受体通用亚基αv配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

目的:利用原核细胞表达牛口蹄疫病毒受体通用亚基整联蛋白αv的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法:以含有牛整联蛋白全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到位于αv成熟肽氨基端的LBD基因片段,经酶切消化处理后,与同样酶切处理的原核表达载体pPRoEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRo/αvLBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达αvLBD蛋白。通过SDS-PAGE鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性。结果:成功构建了pPRo/αvLBD原核表达载体,实现了重组αvLBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其Mr约为40000,主要以包涵体形式存在于菌体中。制备的兔多克隆抗体效价达1∶25600以上。以Western blot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性。结论:实现了牛口蹄疫病毒受体通用亚基αvLBD的高效表达和高效价多克隆抗体的制备,为深入研究整联蛋白αv在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础。

左旋咪唑对大鼠脑组织咪唑啉2受体-配体结合试验的影响

目的研究左旋咪唑(LMS)对大鼠脑组织咪唑啉2受体(I_2R)的影响。方法采用受体-配体竞争结合试验,观察LMS与受体的结合能力;采用受体-配体饱和试验,测定LMS处理大鼠和对照组大鼠脑内I_2R最大受体结合容量(B_(max))和平衡解离常数(K_d)变化。结果LMS抑制了放射性配基[~3H]idazoxan与大鼠脑组织内I_2R的结合,其半数抑制浓度(IC_(50))为4.04×10^(-7)mol·L^(-1)。LMS长期处理大鼠,脑内I_2R亲和力上调63%。结论LMS能与I_2R结合,长期应用LMS能通过刺激I_2R而改变了受体亲和力。

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体的制备

以纯化的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域重组蛋白为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,制备口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域单克隆抗体(McAb);采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,并用SDS-PAGE、间接ELISA以及间接免疫荧光法对制备的McAb的特异性进行鉴定。结果显示,成功获得5株能稳定传代并分泌抗β6亚基配体结合域的杂交瘤细胞株,分别命名为C4C7、E7C7、B8C9、C2D8和B7B6,其分泌的McAb为IgG2b(C2D8)和IgG2a(C4C7、E7C7、B8C9、B7B6)亚类。制备的口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域McAb可为深入研究整联蛋白αvβ6在口蹄疫病毒感染过程中的作用奠定基础。

人血管内皮生长因子受体Flt-l胞外配体结合域的筛选及其结构分析(英文)

目的应用酵母双杂交系统筛选人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外最小配体结合域。方法采用PCR技术,从人胎盘cDNA文库扩增出4个截短的Flt-1cDNA,分别含胞外第2、1-2、2-3和1-3个loop,构建酵母双杂交系统融合表达质粒,并将pGBT9/hVEGF165与pGAD424/Flt-1s两两配对转化酵母菌SFY526。采用滤纸法和液体培养法对阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析。结果Flt-1胞外loop2-3与loop1-3的配体结合能力相差不大,loop1-2的结合力较弱,单独第2个loop无配体结合能力。结论利用酵母双杂交系统,筛选出了Flt-1胞外最小配体结合域-2-3loop,这对研制分子量更小、安全性更高的可溶性Flt-1片段,开发其在肿瘤、糖尿病性视网膜病变等血管生成相关疾病基因治疗中的应用具有重要的指导意义。

口蹄疫病毒受体羊源整联蛋白β6亚基配体结合域的原核表达、纯化及鉴定

利用原核细胞表达羊口蹄疫病毒(FMDV)受体整联蛋白β6亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白。以含有羊整联蛋白β6亚基全长cDNA的质粒为模板,PCR扩增得到β6LBD基因片段,经酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pPROEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRO/β6LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导表达重组羊β6LBD融合蛋白。SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达并利用镍离子亲和树脂对其纯化,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot方法分析鉴定表达产物。成功构建了pPRO/β6LBD原核表达载体,实现了羊FMDV受体整联蛋白亚基β6LBD在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为33 kDa,重组蛋白主要以包涵体形式存在于菌体中。用本试验室保存的抗FMDV受体猪源整联蛋白β6亚基LBD的单克隆抗体进行ELISA和Western blot检测,显示该单抗可与重组目的蛋白发生特异性反应,证明纯化后的蛋白与特异性抗体具有良好的特异性反应及抗原活性。为深入研究整联蛋白受体β6亚基在羊体内的分布及其在FMDV致病过程中的作用机制奠定了基础。

猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.

癫痫持续状态大鼠模型的GABAA受体亚单位α1的mRNA表达及[^3H]Flunitrazepam受体配体结合的变化

目的 :本实验研究大鼠癫痫持续状态动物模型的海马等部位 GABAA受体α1亚单位基因表达和受体一配体结合的变化。方法 :成年雄性大鼠经腹腔内注射 32 0～ 34 0± 5 .87毫克 /公斤毛果芸香碱 (Pilocarpine)以制成癫痫持续状态动物模型 ,能在癫痫持续状态 (定义为在皮质脑电图上显示痫性放电的至少 40分钟的持续性痫性发作 )下存活的大鼠在 1小时和 2小时后处于死 ,分别研究 GABA受体基因表达和放射结合位点 ,用原位杂交方法来测定脑部 m RNA水平 ,用 [3H]flunirazepam标记 GABAA 受体 benzodiazepam结合位点。结果 :动物痫性发作 2小时后海马的 CA1和CA3区域 GABAA受体 α1亚单位 m RNA显著下降 ,但是齿状回的 α1m RNA没有变化。 [3H]flunirazepam标记受体 -配体放射结合在持续 2小时持续痫性发作后可见海马的 CA1及 CA3和齿状回中均见下降 ,1小时的持续痫性发作尚未引起海马区域的任何α1m RNA或 [3H]flunirazepam受体 -配体放射结合的任何改变 ,并用结晶染色 1及 2小时后的大脑海马部位。结论 :本研究结果提示大鼠的癫痫持续状态可诱发海马区 GABAA 受体 α1基因表达的改变和 [3H]flinirazepam受体 -配体结合的下降 。

放射性配体结合分析法测定鸡视网膜多巴胺D1受体

用放射性配体[3H]SCH23390建立鸡视网膜多巴胺D1受体的放射性配体结合分析法，并测定不同试验组鸡视网膜多巴胺D1受体的Bmax值有显著性差异，KD值无明显差异．同时探讨了干，湿滤膜片对放射性测定结果的影响，以及影响试验结果的其它因素．实验表明湿滤膜片测量效果优于干滤膜片，膜受体即使贮存在-20℃条件下亦只能一周，否则影响受体的活性．

功能矫形对大鼠翼外肌细胞膜乙酰胆碱受体最大结合容量影响的研究

目的 观察功能矫形前伸青春期大鼠下颌后 ,翼外肌细胞膜乙酰胆碱受体 ( n- Ach R)最大结合容量 ( Bmax)的变化 ,探讨功能矫形的神经肌肉调控机理。方法 选用 2 0只 5周龄 Sprague- Dawley雄性大白鼠 ,随机分为实验组和对照组各 10只。实验组大鼠戴自制上颌功能矫治器 ,引导下颌前伸。采用放射受体分析法测定两组大鼠翼外肌肌细胞膜上乙酰胆碱受体的最大结合容量。结果 实验组大鼠翼外肌细胞膜上乙酰胆碱受体最大结合容量 ( Bmax=2 85 .5 73 fmol/mg pro)明显 >对照组 ( Bmax=2 14 .662 fmol/ mg Pro) ,其差异具有统计学意义 ( P<0 .0 1)。

雌激素受体ERβ配体结合区的异源表达与纯化

为研究环境化合物与雌激素受体的相互作用,在大肠杆菌中异源表达了人雌激素受体ERβ的配体结合区(hERβ-LBD)蛋白。在诱导剂(IPTG)浓度为0.2mmol.L-1,培养温度25℃,诱导时间为8h的优化表达条件下,经亲和色谱法纯化后,hERβ(LBD蛋白的产量可达236mg.L-1.

1种胞外域仅含1个配体结合区的鸭催乳素受体基因的剪接异形体克隆及基因多态性分析

旨在了解鸭催乳素受体的作用,应用RACE技术克隆到了1种胞外域仅含1个配体结合区的剪接异形体。序列分析表明,剪接异形体长2 535bp,含431bp 5′-UTR、1 884bp编码区和220bp 3′-UTR,可划分为11个外显子。预测蛋白含627个氨基酸,成熟蛋白603个氨基酸,N端为24个氨基酸信号肽。不同于胞外域串联2个配体结合区的典型禽类催乳素受体,预测蛋白胞外域仅含1个配体结合区,类似于哺乳动物催乳素受体。配体结合区同样含有2对半胱氨酸残基和1个WSXWS的5肽WS基序,此为细胞因子受体超家族I型受体中高度保守的2个典型特征。同时,筛选了催乳素受体基因的1个突变位点和1个SNP位点,分别位于5′-及3′-UTR区。其中,3′-UTR区SNP位点经χ2适合性检验,在鸭群体中未达到Hardy-Weinberg平衡状态。