绿色荧光蛋白与鼠盘状结构域受体2融合基因的构建与表达

目的: 构建以绿色荧光蛋白 (GFP)为报告基因的重组表达质粒DDR2 /pEGFP N3并分析该融合基因在活细胞中的表达.方法: 利用反转录PCR扩增鼠盘状结构域受体2(DDR2)cDNA,并重组于pEGFP N3载体.脂质体体外瞬时转染培养的COS 7细胞,RT PCR和WesternBlot分析该融合基因的表达.结果: 从NIH3T3细胞中克隆到DDR2基因的cDNA,并成功构建DDR2 EGFP融合表达载体.以该质粒转染细胞 48h后,RT PCR和WesternBlot分析表明该融合基因能够在COS 7细胞中正确表达.结论: DDR2 /pEGFP N3融合基因真核表达载体构建成功.该融合蛋白具有DDR2和EGFP双重特性,为进一步研究DDR2的功能提供了工具.

白细胞介素2受体α链(IL-2R_α):基因结构及表达调控

IL-2 R基因结构及表达调控是当代免疫学研究的重要课题,其阐明有助于揭示机体免疫应答及调节的机制。自1984年IL-2R_α链cDNA克隆建立以来,该领域研究已有很大突破,本文概要介绍了这方面的进展。

小鼠脂联素受体2基因编码区的克隆及序列分析

构建小鼠脂联素受体2(mAdipoR2)基因cDNA克隆,并进行序列及基因结构分析,为进一步研究小鼠AdipoR2的表达和生物学活性奠定基础。用RT-PCR方法扩增mAdipoR2基因cDNA,获得的片段连接至pGEM-T载体,转化JM109大肠杆菌,经酶切鉴定后,进行序列测定。利用因特网生物信息学资源分析mAdipoR2基因序列。结果成功地构建了mAdipoR2基因cDNA克隆,其序列与GenBank登录序列一致。通过与小鼠基因组序列比对,分析了mAdipoR2基因结构,其编码序列由7个外显子组成,编码1个含7个跨膜区的膜蛋白,但该受体不属于G蛋白偶联受体家族(GPCRs)。mAdipoR2与人及大鼠蛋白的同源性分别为91%和95%。

盘状结构域受体2胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定

目的:盘状结构域受体2(discoidin domain recep-tor2,DDR2)是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酪氨酸激酶,研究DDR2在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)软骨破坏和肿瘤转移中的作用.方法:在毕赤酵母中表达DDR2胞外区片段(不含信号肽和跨膜区,命名为DR),并将所表达的蛋白进行纯化和功能鉴定,以备将来用作DDR2的特异性阻断剂.结果:获得了两株较高表达His-DR融合蛋白的毕赤酵母克隆;其表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的18%;经Ni-NTA(nitric-tri-acetic acid)柱纯化后,获得了纯度约90%以上的可溶性His-DR融合蛋白;竞争结合抑制实验显示,His-DR具有阻断和细胞表面天然DDR2受体结合的功能.结论:所表达的融合蛋白His-DR具有抑制天然DDR2功能的作用.

应用抑制性消减杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白2反式调节基因

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白2(NS2)反式调节基因cDNA消减文库,研究HCVNS2蛋白的反式调节基因。方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选转染pcDNA3.1(-)NS2和空载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞差异性表达基因,并进行生物信息学分析。结果:获得12个差异表达的已知蛋白基因和3个未知功能基因序列,包括:磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)、酸性核糖体磷蛋白PO、核糖体蛋白L13a、整合素β1、天冬酰胺合成酶、信号肽酶、α2HS糖蛋白、小核糖体蛋白多肽G、蛋白酶样亚单位、黄体酮受体、SDR家族脱氢酶8、Ras家族RAB4A、具有BTB/POZ结构的新蛋白、具有coiled coil helix结构的新蛋白、未知功能基因。结论:成功构建HCVNS2反式调节的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制提供了线索。

离子通道受体P2X4的结构及生物学功能

P2X4受体是P2X受体家族的成员。目前 ,已从人、大鼠、小鼠、鸡胚和非洲爪蟾的组织中获得了全长cDNA。P2X4受体分布广泛 ,在被ATP及其同系物激活后 ,引起细胞内钙离子浓度显著升高 ,将信号传递给下游的信号分子。

急性冠脉综合征患者血清sST2及NLRP3水平与介入术后无复流-慢血流的相关性分析

目的探讨急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,Acs)患者血清可溶性生长刺激表达基因蛋白2(soluble growth stimulation expression gene 2 protein,sST2),核苷酸寡聚化结构域样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nucleotide oligomerization domain like receptor heat protein domain associated protein 3,NLRP3)水平与经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)术后无复流-慢血流的关系。方法选择2020年1月~2022年12月佳木斯市中心医院收治的97例急性冠脉综合征患者,所有患者均接受PCI治疗,根据术后无复流-慢血流发生情况分为无复流-慢血流组(n=20)和对照组(n=77)。术前检测血清sST2及NLRP3水平,分析影响急性冠脉综合征患者PCI术后无复流-慢血流的因素以及sST2,NLRP3预测急性冠脉综合征患者PCI术后无复流-慢血流的价值。结果无复流-慢血流组血清sST2(14.32±2.65 ng/ml vs 11.02±2.13 ng/ml),NLRP3(68.23±10.17 pg/ml vs 42.05±8.23 pg/ml)水平高于对照组,差异具有统计学意义(t=5.860,12.055,均P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示高血栓负荷(OR:7.791,95%CI:2.834~21.421)、高水平sST2(OR=2.071,95%CI:1.146~3.743)、高水平NLRP3(OR=2.008,95%CI:1.228~3.284)是急性冠脉综合征患者PCI术后无复流-慢血流的危险因素(均P<0.05)。sST2,NLRP3诊断急性冠脉综合征患者PCI术后无复流-慢血流的临界值分别为12.91ng/ml,55.39 pg/ml,曲线下面积分别为0.737,0.686,联合sST2,NLRP3诊断急性冠脉综合征患者PCI术后无复流-慢血流的曲线下面积为0.907,高于单独诊断(Z=2.662,2.856,均P<0.05)。结论急性冠脉综合征患者血清sST2,NLRP3水平增高与PCI术后无复流-慢血流的发生有关,联合检测sST2和NLRP3可提高对术后无复流-慢血流的诊断效能。

Tie-2受体在大肠癌组织中的表达与血管生成

目的 探讨Tie 2在大肠癌组织中的表达及其与血管生成的关系。方法 利用免疫组化SABC法 ,对 10 6例大肠癌组织及 2 0例正常大肠组织中的Tie 2受体表达进行研究。结果 Tie 2受体主要表达于癌组织及癌组织旁的血管内皮细胞上 ,Tie 2受体在大肠癌组织中的表达阳性率显著高于正常组织 (P <0 .0 1) ,Tie 2受体的表达与病理类型、分化程度及临床分期无关 (P >0 .0 5 )。结论 Tie 2受体在大肠癌的血管生成调控中具有重要作用。

抑制SHP2和FGFR2调控RAS/ERK及PI3K/AKT通路治疗FGFR2融合胃癌

目的:探究共抑制成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)和Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2(Src homology region 2-containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)在FGFR2融合胃癌中的应用前景与作用机制。方法:构建过表达TACC2-FGFR2融合基因与对照慢病毒载体的人胃癌细胞系MKN45ACC2T-FGFR2、MKN45NC、NUGC4TACC2-FGFR2、NUGC4NC,分别用FGFR2抑制剂AZD4547、SHP2抑制剂SHP099或联药进行处理,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)、划痕实验检测肿瘤细胞的增殖、迁移能力。以不同处理方式作用于MKN45TACC2-FGFR2、MKN45NC1 h或48 h后,采用Western blot法检测FGFR2、SHP2以及下游RAS/ERK、PI3K/AKT信号通路变化。结果:在MKN45TACC2-FGFR2与NUGC4TACC2-FGFR2中联用AZD4547与SHP099可以比单药更显著地抑制肿瘤细胞的增殖与迁移。药物处理1 h后,相较于AZD4547单药,联药在MKN45TACC2-FGFR2中进一步抑制了RAS/ERK、PI3K/AKT信号通路。药物处理48 h与1 h相比,AZD4547单药组中磷酸化FGFR与磷酸化SHP2出现了反馈性激活,且始终不能抑制RAS/ERK通路,但联药组可以持续地抑制上游的FGFR2、SHP2信号以及下游的RAS/ERK、PI3K/AKT通路。结论:共抑制FGFR2和SHP2可以通过下调RAS/ERK及PI3K/AKT通路有效抑制FGFR2融合胃癌,为FG-FR2融合突变胃癌患者带来新的治疗模式。

我国食源性诺如病毒GⅡ.2[P2]型毒株基因组结构与衣壳蛋白功能研究

食源性诺如病毒(Norovirus)是引起全球食品安全事件的主要微生物病原,具有丰富的遗传多样性,基因型较复杂,近年来GⅡ.2逐渐成为我国主要流行基因型之一。为了解食源性诺如病毒GⅡ.2型变异特点,该研究以2015年在广州地区检出的GⅡ.2[P2]型GZ2015-L335毒株为对象,对其基因组结构及衣壳蛋白功能进行了系统表征。该毒株基因全长为7 496 bp,在线基因分型结果表明其为GⅡ.2[P2]基因型。通过克隆其衣壳蛋白VP1基因,借助杆状病毒表达系统获取重组VP1蛋白,并采用氯化铯密度梯度离心法进行纯化。SDS-PAGE和Western blot实验结果表明重组VP1蛋白分子量约为58 ku;透射电镜结果显示该蛋白可自组装形成直径约为30 nm的病毒样颗粒(Virus-like Particle,VLP);ELISA结果显示该VLP与抗GⅡ.2[P]衣壳P颗粒血清具有较高结合活性。此外,受体结合实验证实该VLP与A/B/O等分泌型及非分泌型唾液呈现出广泛的结合作用。该研究对GⅡ.2[P2]型GZ2015-L335毒株基因组结构进行了系统分析,成功制备并表征了其病毒样颗粒,结果将为食源性诺如病毒的高效抗体研制及新型检测技术研发提供支撑。

Tie2介导的基因导入系统转导p53基因对肺癌的抑制作用

目的:探讨Tie2介导的基因导入系统体内靶向转导p53基因治疗肺癌的效果。方法:应用双功能交联剂SMCC将Tie2配体寡肽GA3与PEI连接构建靶向Tie2的基因载体。体外试验将GA3-PEI/luciferase导入Tie2表达阳性的SPC-A1肺癌细胞与Tie2表达阴性的SMMC7721肝癌细胞中,24 h后检测luciferase活性。体内导入试验将GA3-PEI/β-gal复合物注射SPC-A1细胞裸鼠种植瘤周围皮下,同时设立PEI/β-gal组为对照;24 h后牺牲裸鼠,检测心、肝、脾、肺、肾和瘤体的β-gal表达。另外将另一批四周龄SPC-A1肺癌种植瘤裸鼠随机分为5组:(1)NS;(2)GA3;(3)p53;(4)PEI/p53;(5)GA3-PEI/p53;每组6只;皮下注射GA3-PEI/p53基因复合物,隔2天1次,并测量肿瘤长短径,计算瘤体积及抑瘤率。结果:GA3-PEI/luciferase组的luciferase活性在SPC-A1细胞中明显高于SMMC7721细胞(P<0.05)。在种植瘤中可见较多蓝染细胞,心、肝、脾、肾组织中几乎不见篮染,肺支气管黏膜除外。与对照组比较,GA3-PEI/p53治疗组对肿瘤生长有明显抑制作用(P<0.05),其抑瘤率为61.29%。结论:GA3基因导入系统靶向转导p53基因,显著抑制肿瘤生长。

激活性受体NKG2D研究进展

NKG2D是一个重要的激活性受体 ,分布广泛。与其他已知的受体 配体相比 。

DDR2血管内皮细胞条件性基因敲除小鼠的复制、鉴定及表型分析

目的应用Cre/LoxP系统复制盘状结构域受体2(DDR2)在血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠模型DDR2i EC(DDR2flox/flox,Cdh5-Cre/ERT2),并分析其在肝脏中的表型。方法复制DDR2打靶载体,通过电转入小鼠胚胎干细胞(ES细胞)打靶,通过聚合酶链反应(PCR)+脱氧核糖核酸(DNA)印迹法鉴定筛选阳性ES细胞,将阳性的ES细胞注射到C57BL/6N小鼠囊胚,移植入受体小鼠子宫以获得嵌合体小鼠。将得到的嵌合体小鼠与C57BL/6N小鼠回交得到F0杂合子,F0代杂合小鼠自交筛选获得F1代DDR2flox/flox小鼠,该小鼠与Cdh5-Cre/ERT2小鼠杂交,通过子代自交获得DDR2在血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除(DDR2flox/flox,Cdh5-Cre/ERT2)小鼠。他莫昔芬诱导血管内皮细胞上DDR2基因敲除,对小鼠进行表型分析。结果获得DDR2血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠DDR2i EC(DDR2flox/flox,Cdh5-Cre/ERT2),DDR2i EC小鼠出生时符合孟德尔遗传定律,发育良好,他莫昔芬诱导敲除小鼠血管内皮细胞DDR2基因表达后,小鼠出现自发性肝纤维化及黄体血管新生障碍等表型。结论成功复制DDR2血管内皮细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠模型。血管内皮细胞DDR2缺失能导致自发性肝纤维化。

前列腺癌中TMPRSS2-ERG融合基因作用机制的研究进展

前列腺癌在欧美国家男性中是最常见的恶性肿瘤,近年来我国的发病率、病死率及其造成的疾病负担呈现明显增加趋势,但前列腺癌的发生发展机制仍未完全明确。跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane serine protease 2,TMPR SS2)与成红细胞病毒E26致癌物(E26 oncogene,ERG)融合基因在前列腺癌中具有特异性,在前列腺癌发生发展过程中发挥重要作用,其作用机制复杂,且与多个基因相互作用,因此深入了解TMPRSS2-ERG融合基因在前列腺癌中的作用机制至关重要,可以为前列腺癌的诊疗提供帮助。

小菜蛾腺苷受体基因PxAdoR克隆及杀虫靶标作用

利用蝉花虫草Ophiocordyceps sobolifera代谢产物N6-（2-羟乙基）腺苷（HEA）作用于小菜蛾Plutella xylostella L.获得差异表达的片段,采用RT-PCR和RACE技术从小菜蛾中克隆全长1828 bp的小菜蛾腺苷受体（Plutella xylostella adenosine receptor,Px Ado R）基因,通过生物信息学软件预测和分析蛋白质结构,Px Ado R为分子量49.2 k D,没有信号肽,疏水性不稳定蛋白,具有7次跨膜螺旋结构的一类G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor,GPCRs）。利用HEA及哺乳动物腺苷受体A2a R抑制剂SCH58261处理小菜蛾2龄幼虫,结果显示联合使用HEA和SCH58261后36~60 h,可使HEA引起的小菜蛾2龄幼虫的校正死亡率显著降低（42.7%~53.9%,P〈0.05）;而联合用药后36、48、60 h小菜蛾2龄幼虫体重增长抑制率由43.3%、38.3%、46.2%显著降低（P〈0.05）到13.2%、10.3%、8.6%。本研究表明SCH58261能显著降低HEA引起的小菜蛾2龄幼虫的死亡率和体重增长抑制率,HEA可能是通过Px Ado R而起作用,Px Ado R基因可以作为新的杀虫靶点用于害虫控制研究。

用酵母单杂交系统筛选人IL-2Rα基因NIRS元件结合蛋白的cDNA

目的筛选与白细胞介素2受体(IL2R)α基因NIRS元件相互作用的结合蛋白。方法采用酵母单杂交体系从HTLV1转化的人外周血淋巴细胞MATCHMAKERcDNA文库中筛选与NIRS相互作用的蛋白。结果经过筛选并排除假阳性后有9个阳性克隆仍保持His+表型和βgal活性;测序后分析发现它们分别属于4个不同蛋白的cDNA克隆。其中一个是已知的反式作用因子Ku抗原,另一个是RNA聚合酶Ⅰ的转录终止因子。它们的C末端分别含有SAP和SANTDNA结合结构域。结论在Jurkat细胞中存在与NIRS元件相互作用的结合蛋白,相关的研究正在进行中。

白细胞介素－2受体γ链研究新进展

白细胞介素－２受体γ链（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ｒｅｃｅｐｔｏｒγｃｈａｉｎ，ＩＬ－２Ｒγｃ）是约３年前发现的ＩＬ－２受体亚单位之一，它不但参与高、中亲和力ＩＬ－２Ｒ的形成，而且作为细胞因子受体超家族成员参与ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９和ＩＬ－１５受体以及可能的ＩＬ－１３受体功能性复合物的形成．ＩＬ－２Ｒγｃ基因结构与功能和蛋白质分子结构以及染色体定位已阐明．ＩＬ－２Ｒγｃ及信号传导的异常导致人类Ｘ染色体连锁重度联合免疫缺陷病（Ｘ－ｌｉｎｋｅｄｓｅｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ＸＳＣＩＤ）．因此，阐明ＩＬ－２Ｒγｃ在生理及病理状态下的生物学作用，对了解淋巴细胞的生长发育和分化成熟、免疫应答及其调控等问题都有重要的指导意义．

LncRNA HAGLR激活RUNX2并抑制NLRP3炎症小体对胫骨骨折愈合的影响

目的研究长链非编码RNA(LncRNA)HAGLR对胫骨骨折(TF)小鼠的NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体表达和骨折愈合的影响并探讨机制。方法体外对成骨细胞MC3T3-E1沉默HAGLR,CCK-8法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡,qPCR法检测骨碱性磷酸酶(BALP)和骨钙素的表达。Western blot法检测RUNX2、磷酸化RUNX2(p-RUNX2)以及NLRP3、半胱天冬酶1(Caspase1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素-1β(IL-1β)的表达。通过小鼠TF手术建立TF小鼠模型,在模型小鼠体内过表达HAGLR,并在过表达HAGLR的基础上沉默RUNX2或加入炎症小体抑制剂MCC950。qPCR法检测HAGLR和RUNX2的表达,Western blot法检测胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的表达。microCT测量小鼠骨痂体积(MBV),称量小鼠的全长胫骨湿重。结果沉默HAGLR导致MC3T3-E1细胞活力降低且凋亡率增加(P<0.05),且RUNX2、p-RUNX2、BALP和骨钙素表达量均降低(P<0.05),NLRP3、Caspase1、ASC、IL-1β的表达量都增加(P<0.05)。与健康组织比较,TF小鼠体内HAGLR和RUNX2表达量降低(P<0.05)。过表达HAGLR促进TF小鼠体内的HAGLR和RUNX2表达,并增加MBV和全长胫骨湿重以及IGF-1的表达量(P<0.05)。在过表达HAGLR的基础上沉默RUNX2导致TF小鼠的MBV、全长胫骨湿重和IGF-1表达量都降低(P<0.05)。而在过表达HAGLR的基础上加入NLRP3炎症小体抑制剂MCC950导致MBV、全长胫骨湿重和IGF-1表达又增加(P<0.05)。结论LncRNA HAGLR通过激活RUNX2并抑制NLRP3炎症小体促进TF的愈合。

前列腺癌细胞内TMPRSS2-ERG融合基因产物转录调控机制研究进展

前列腺癌在欧美国家男性中是最常见的恶性肿瘤,但前列腺癌的发生发展机制还未完全明确。在前列腺癌中,TMPRSS2-ERG融合基因具有较高的发生率,其促进ERG过表达,引起相应的靶基因和信号通路改变,如雄激素受体、斑点型锌指结构蛋白、Notch通路等。深入了解前列腺癌细胞中TMPRSS2-ERG融合基因产物转录调控机制,可以为前列腺癌的治疗提供新的药物作用靶点。

Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法

目的:探讨Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法。方法:将Grb7蛋白SH2结构域编码基因与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签编码基因构建为融合基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点EcoRⅠ与XhoⅠ之间,挑选测序正确的质粒将其转染至BL 21感受态细胞内,感受态细胞于37℃摇培至其OD值达到0.6～0.8后,经0.2 mmol/L IPTG 25℃过夜诱导表达融合蛋白,MALDI-TOF质谱检测蛋白纯化产物,SPR生物传感器(Biacore 3000)检测纯化蛋白与天然配体磷酸化肽段的相互作用。结果:GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白在裂解菌液的上清液中存在,500 ml LB/Amp菌液可纯化得到415μg GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白,MALDI-TOF质谱图上可见明显目的蛋白峰,Biacore 3000检测到纯化蛋白可结合不同浓度的磷酸化肽段配体。结论:运用改进的GST融合蛋白纯化方法可得到具有一定纯度及生物学活性的GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白,为该蛋白结构域后续功能研究奠定了基础。