受激发射损耗显微术及其在生物医学上的应用

由于受到光学衍射的限制,均匀照明宽视场荧光显微术和激光共焦扫描显微术的分辨率约为200～300nm。近年来受激发射损耗显微术在突破衍射极限以及应用方面取得许多令人瞩目的成果。本文简要介绍受激发射损耗显微术的原理、方法及其在生物医学上的应用。

受激发射损耗显微技术中0/π圆形相位板参数优化

采用光的矢量衍射理论,研究了0/π圆形相位板不同设计参数对于受激发射损耗(STED)显微镜中抑制光形成中空聚焦光斑聚焦质量的影响,并进行了数值模拟。相关计算结果表明,当采用不同偏振态、不同光强分布的入射光作为STED光,0/π圆形相位板内径的合理取值范围是不同的,而系统所用物镜的数值孔径对于内径的取值影响较小。在各种不同的参数组合下,使用线偏振光和圆偏振光作为入射光时,0/π圆形相位板内径取值范围基本保持一致;当入射光为径向偏振光时,内径取值则相对较大;而当使用切向偏振光时,任何取值均无法在系统焦平面附近得到满意的中空聚焦光斑。

受激发射损耗显微中数值孔径对偏振光聚焦特性的影响

受激发射损耗(STED)显微可以打破衍射极限,观测到小于200 nm的细胞器内部结构。利用径向偏振光通过大数值孔径(NA)成像可以提高STED系统的分辨率。计算了径向偏振光径向光强分布和纵向光强分布,并分析了数值孔径变化时径向光强分布和纵向光强分布的变化。结果表明:纵向聚焦光斑比径向聚焦光斑小,且随着NA的增大,径向偏振光径向聚焦光斑和纵向聚焦光斑尺寸均变小,强度曲线图的半峰全宽(FWHM)也变小,光强分布更加集中。因此,增大NA可以提高STED显微成像系统的分辨率。

受激发损耗(STED)显微术及在生物邻域的应用

受激发射损耗(STED)显微成像通过引入一束损耗光以受激发射的方式减小有效荧光的发光面积,激发光激发样品的荧光基团形成一个艾里斑,损耗光生成中空型的面包圈抑制艾里斑周围的荧光强度,使我们仅看到中心的强度。基于StefanW.Hell第一次提出受激发射损耗显微术,本文介绍了受激发射损耗(STED)显微术的发展过程,并阐述了近几年来,STED在生物领域的应用。最后,总结和展望了该技术的应用前景。

超分辨显微技术在活细胞中的应用与发展

细胞是生命体的基本单位和功能单位,对活细胞内部结构及其功能的研究是了解掌握生命本质的基础之一,因此活细胞的实时观测对生命科学的发展具有重要意义。传统的光学显微技术受衍射极限的限制,无法观测200 nm以下的生物结构细节。近20年来,随着超衍射极限光学理论、技术、器件和荧光探针等方面的快速发展,超分辨显微成像技术已成为应用于生命科学研究的重要手段。然而,大多数超分辨显微方法或测量耗时长,或易引起荧光蛋白漂白/细胞损伤,在活细胞研究中受到极大限制,已成为超分辨显微领域重点攻关的方向之一。为此,文中结合作者在快速超分辨显微技术研究的基础上,介绍了基于单分子成像的光激活定位显微技术和随机光学重构显微技术、基于荧光非线性可饱和光转换的受激发射显微技术以及基于结构光照明的超分辨显微技术,并探讨了在活细胞成像中的发展应用。最后,文中展望了超分辨显微成像技术在活细胞成像中的未来发展趋势。

超分辨显微成像技术在活细胞成像中的应用与发展

超分辨显微成像技术(super-resolution microscopy,SRM)可以绕过光学衍射极限对成像分辨率的限制,让以前观察不到的纳米级结构实现可视化,这一重大研究进展推动了现代生命科学和生物医学研究的进步与发展.细胞是生物体的基本组成单位,对活细胞内部的细微结构和动力学过程进行研究是掌握生命本质必不可少的途径.但由于成像原理或条件的限制,早期的SRM技术在活细胞成像应用方面受到了不同程度的限制.近几年来,随着SRM和相关技术的发展,SRM在活细胞成像研究中的应用也越来越多.本文简要介绍目前常见的几种SRM技术的基本原理和特点,并在此基础上着重阐述它们在活细胞成像应用中所取得的最新研究进展和发展方向.

高数值孔径对STED超分辨显微成像技术的影响

在本文中,我们分析了不同高数值孔径对受激发射损耗(STED)显微中损耗光光强分布的影响。根据Debye矢量衍射积分公式,模拟计算了STED显微成像中,损耗光经过螺旋相位板,再经过高数值孔径(NA)透镜时的聚焦特性。从结果中我们可以得到,当数值孔径增大时,损耗光的半高宽(FWHM)大小会减小,但是当NA从1.15变到1.30时,半高宽保持不变,当NA=1.35,1.4的时,半高宽有向上增加的趋势。结果表明:一般来说当NA增大时,STED显微的分辨率是提高的,但是不能严格地说,数值孔径越大,STED显微镜的分辨率越大。

超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的应用(特邀)

观察细胞器间动态相互作用,深入分析作用规律,对于揭示生理病理过程现象背后的机制具有十分重要的意义。传统光学显微镜受到由光波波长和孔径造成的衍射极限的限制,无法观测细胞器纳米级精细结构及细胞器间相互作用的动态变化规律。超分辨显微成像技术的出现为细胞器相互作用研究提供了重要手段,在深入揭示细胞器相互作用规律,阐明生理病理现象深层的机制研究中发挥了重要的作用。文中介绍了受激发射损耗(Stimulated emission depletion,STED)显微成像、结构光照明显微成像(Structured illumination microscopy,SIM)、单分子定位显微成像(Single molecule localization microscopy,SMLM)技术,并总结了这三类超分辨显微成像技术在细胞器相互作用中的应用与现状,为超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的应用提供思路拓展。最后,对超分辨显微成像技术在细胞器相互作用研究中的优势与不足进行分析总结,展望了超分辨显微成像技术在活细胞内细胞器相互作用成像中的需求发展趋势,为光学与医学及生物学的交叉融合发展提供一定的参考。

基于时间相关单光子计数的离线式g-STED超分辨显微术

提出了一种离线式基于时间门的荧光受激发射损耗(g-STED)显微方法。基于在强光照条件下荧光寿命缩短的理论模型,在常规STED架构基础上,使用时间相关单光子记数(TCSPC)算法获取图像的荧光寿命信息,离线设置合理的时间门阈值,丢弃短寿命信号数据,对荧光信号有效点扩展函数(PSF)进行压缩,达到超分辨显微的目的。与传统STED显微术相比,此方法所需光功率大幅度降低,减少了荧光漂白及光毒性;离线式处理则同时增加了时间门设置的灵活性。在实验中,使用45mW的连续STED光,最终获取了约80nm的图像空间分辨率。进一步对时间门的设置对获取图像信号的分辨率和信噪比的影响进行了讨论。

活细胞超分辨荧光显微成像技术前沿与进展

本文系统综述了活细胞超分辨荧光显微成像技术相关研究进展,探讨了领域内研究现状及热点问题,并归纳总结了超分辨技术在活细胞成像中的应用。本文具体概括了该技术在相关领域取得的多方面研究进展,其中结构光照明显微术、受激发射损耗显微术以及最低光子通量显微术是当前研究的热点和前沿。根据当前领域内的发展态势,本文预计未来基于人工智能和荧光探针及其标记方法的创新将是该领域未来一段时间的重点发展方向。

超分辨显微成像技术在活体大脑成像中的应用

超分辨显微成像技术是生物医学领域的重要成像工具,它通过突破光学衍射的极限,以纳米级尺度解析大脑神经元的结构,其在活体大脑成像中的应用对于神经科学的发展具有重要影响。由于组织光散射、生物相容性、成像系统兼容性等因素,超分辨显微成像技术在活体大脑成像的深度、速度、时间等方面都受到限制。基于传统的双光子显微成像策略,本文介绍了目前应用于活体大脑成像的受激发射损耗显微成像和结构光照明显微成像的研究进展,分析了它们存在的困难和挑战,最后总结了应对挑战的思路并对未来的发展进行了展望。

单分子技术在G蛋白偶联受体二聚体中的应用

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)不仅能以单体的形式发挥生物学作用,还可以相互作用形成同源/异源二聚体,后者是调节受体功能的一种重要方式,能改变下游信号蛋白的偶联,产生特异信号转导通路,介导一系列生理和病理过程,如心血管调节、能量代谢等。因此,GPCR二聚体成为新型药物靶点之一,备受关注。但是以往对GPCR二聚体的研究一直是按总体平均水平(ensemble average)进行,这隐藏了有价值的信息,失去了生物异质性的有用数据。单分子技术具有前所未有的时空分辨率,能够直接显示GPCR二聚体的内部状态、运动轨迹,以及随着时间和周围环境的变化而转变等,有助于进一步剖析GPCR二聚体的关键作用和相关药物的开发。因此,该文将对研究GPCR二聚体的单分子技术(如全内反射荧光显微镜、受激发射损耗显微技术、基态耗尽显微术等)进行简要综述。