受激辐射损耗超分辨显微成像系统研究的新进展

由于受到衍射极限的影响,传统光学显微镜的分辨率被限制在半个波长左右.近二十年来出现了许多通过不同方法绕过光学衍射极限的超分辨成像技术,其中,受激辐射损耗显微(stimulated emission depletion microscopy,STED)通过引入一束环形损耗光来抑制荧光光斑外围荧光分子的发光,以达到减小点扩散函数的目的,实现超分辨成像.经过近些年的发展,STED系统无论从光束的产生、校准和扫描,还是最后的成像,都有了很大的发展.本文将简要介绍STED成像技术的基本原理,详述STED超分辨成像技术出现至今在光源、扫描及成像系统等方面的进展,以及在三维成像和多色成像方面的发展现状,STED技术与其他显微技术的结合.最后,本文对STED技术近几年的研究新进展进行了系统的论述,对STED技术未来的发展趋势进行了探讨.

基于受激发射损耗显微术的活细胞和活体超分辨成像

细胞作为生命体基本的结构和功能单元,在生物、医学等领域有着非常重要的研究意义。随着现代科学和技术的发展,科学家们借助电镜对细胞以及细胞器的空间结构已经有非常清晰的认识,但是对它们的功能以及细胞之间的相互作用却了解得非常少,而这恰恰又是疾病治疗和药物开发亟需了解的信息,因此对离体活细胞(简称活细胞)和活体生物组织细胞(简称活体细胞)中亚细胞器的研究变得非常重要。然而细胞中许多细胞器的结构在纳米量级,传统的光学成像技术由于受到光学衍射极限的限制是无法观察到纳米量级的生物结构,因此光学超分辨成像技术是目前研究亚细胞器结构和功能的有效工具。在所有光学超分辨显微技术中,受激发射损耗显微术(stimulated emission depletionmicroscopy,STED)由于具有实时成像、三维超分辨和断层成像的能力,非常适合用于纳米尺度的活细胞和活体细胞成像研究,而且STED超分辨成像技术经过近几十年的发展,已经广泛用于活细胞甚至活体小鼠细胞的超分辨动态观测。本文总结了近年来活细胞和活体小鼠神经元细胞等领域STED超分辨成像的研究进展,介绍了用于活细胞和活体细胞STED超分辨成像的荧光染料和荧光蛋白的发展现状,讨论当前活细胞和活体细胞的超分辨成像面临的问题,以及对未来发展的展望。

受激辐射损耗超分辨成像技术研究

受激辐射损耗显微成像(STED)是一种超分辨荧光显微成像技术,它能够突破传统光学衍射极限的限制,把远场光学分辨率提高到百纳米以内,被广泛应用于生物医学等领域,是目前光学显微成像领域研究的热点之一。采用了一种基于超连续谱皮秒脉冲白激光光源的STED显微系统,实现超分辨成像。并从精密合束、脉冲延迟和损耗光残留光强几个方面探讨系统优化,从而获得最佳的成像效果。对直径约25 nm荧光微球成像实验的数据表明:该系统成像分辨率可达约60 nm,分辨能力远远高于衍射极限。另外,系统成功实现了对核孔复合物、微管和微丝等一系列生物样品的超分辨成像,共聚焦成像中某些模糊不清的结构在STED成像中清晰可辨。

基于受激增益与自发衰减的激发-探测显微技术

基于激发-探测显微技术研究受激增益与自发衰减现象。采用脉冲二极管激光器(λ_(pu)=635 nm作为激发光束)与锁模掺钛蓝宝石激光器(λ_(pr)=780 nm作为探测光束)。受激增益部分,发射光束在频率f_1被调制,利用光电二极管作为探测器(PDA 36A,Thorlabs),探测光被相应地解调来提取透射方向的信号;自发损耗部分,探测光束在频率f_2被调制,从探测荧光由光电倍增管以反射模式解调自发损耗信号。所有情形下使用高性能锁模放大器(HF2LI,Zurich Instruments)。锁模放大器的输出信号接着输入扫描单元的A/D通道用于图像重构。扫描速率设为频率500 Hz,与锁模放大器1.99 ms的时间常数相匹配。由解调荧光信号获取背景大大减少的荧光寿命和光学部分属于散粒噪声的图像。另外,此技术改善信噪比,提高类似多光子显微镜的穿透深度,无须昂贵的飞秒激光器。

偏振态、相位和振幅对受激辐射损耗中损耗光焦斑的影响

针对受激辐射损耗(STED)超分辨显微术分辨率不够高的问题,研究了损耗光偏振态、相位和振幅多种物理量对焦斑的影响,以形成半峰全宽窄的圆环形损耗光焦斑。根据Richards-Wolf矢量衍射理论,建立了偏振态、相位和偏振态作用下的损耗光焦斑模型;计算了不同偏振态、不同相位振幅调制参数下损耗光焦斑的分布情况;通过优化各参量得到有效激发荧光的分布。计算结果表明,应用切向偏振时的损耗光焦斑半峰全宽优于应用径向偏振和圆偏振;相位和振幅的调制作用均能减小半峰全宽;优化后有效激发荧光的理论半峰全宽仅为13.2nm。采用损耗光的偏振态、相位和振幅对损耗光焦斑进行整形,能够有效减小半峰全宽,获得较高的理论分辨率,比仅使用单一物理量的效果更好;应用切向偏振光能够获得高质量的损耗光焦斑和超衍射极限的分辨能力,根据不同实际情况选择相位或振幅调制的方法可进一步提高分辨率。

一种用于线粒体受激辐射损耗超分辨成像的新型探针

受激辐射损耗(stimulated emission depletion,STED)显微技术通过巧妙的光学设计,利用纯光学的方法突破了光学衍射极限,空间分辨率达到纳米量级,并保留了荧光显微的许多优点.然而,高的损耗光强度限制了STED显微技术的广泛应用,尤其在活细胞成像方面.本文找到了一种新型的具有良好线粒体靶向性的STED探针,具有较强的抗光漂白特性和较低的饱和擦除光强度3.5 mW(1.1 MW·cm–2),利用该探针最高可获得62 nm的空间分辨率,为活细胞线粒体STED超分辨成像提供了新的手段.

基于点扫描的超分辨显微成像进展

光学显微镜一直推动着现代科学技术的发展.随着科学的进步,对显微成像分辨率的要求在生物、材料等领域日渐凸显,而常规宽场显微成像一直面临着成像分辨率衍射受限的问题.1968年出现的共聚焦显微镜作为点扫描显微镜的开端第一次实现了远场下成像分辨率的突破,它具有层切性好、信噪比高等优点.在1994年出现的受激辐射荧光损耗显微镜将显微成像能力突破到2.8 nm左右,并成为目前效果最佳、应用较广泛的超分辨显微技术.荧光差分显微和饱和荧光吸收竞争等点扫描技术具有无荧光染剂限制、饱和光强低、光路简单等优势,并且能取得1/6波长的分辨能力,进而在超分辨显微领域仍有着发挥空间.Airyscan技术作为以上方法的补充可以弥补点扫描系统中由于探测小孔半径减小而带来的信号丢失,从而提高成像信噪比和分辨率,但阵列探测器成本较高.上述点扫描显微镜通过改变照明或者探测的方式实现了分辨率突破.本文详细讨论了点扫描超分辨方法的原理、成像效果及面临的瓶颈,并分析了点扫描超分辨显微镜在应用和技术上的趋势.

受激辐射耗尽荧光显微镜的原理与实验装置研究进展

介绍了四能级系统的受激辐射耗尽(STED)荧光显微镜的基本原理。按照时间顺序介绍了面包圈型耗尽光焦斑的实现方法。对于横向分辨率的改善,最初使用了光路偏移法,后来发展到均分相位板法,再到成熟的螺旋相位板法;另外还介绍了半波相位板法对轴向分辨率的改善。从宽带光源激发、连续光源激发、多色多通道、快速成像和双光子激发等方面综述了受激辐射耗尽荧光显微镜实验装置的逐步完善。最后展望了受激辐射耗尽荧光显微镜的发展前景。

受激发射损耗显微中空心损耗光的光强分布优化研究

受激发射损耗显微技术(STED)作为一种远场超分辨显微成像技术,具有几十纳米甚至几纳米的空间分辨率,是细胞生物学等研究领域的重要成像工具。圆环形空心损耗光在物镜焦点附近的光场强度分布对STED空间分辨率起决定性作用。在高数值孔径物镜聚焦下,光场的偏振态会对聚焦光场的强度分布产生显著的影响,此外,显微系统的轴外像差会严重破坏空心损耗光焦斑的中心对称性。基于矢量衍射理论,理论模拟了在高数值孔径物镜聚焦条件下,入射涡旋光的偏振态和光学系统中的彗差和像散对空心损耗光焦场强度分布的影响。实验上使用纯相位型空间光调制器来校准光学系统相差,优化变形的损耗光,利用纳米探针扫描焦点区域,测量了其焦场强度分布。测量结果与由矢量稍微理论观测的结果一致。

三维超分辨显微成像技术的研究进展及展望

超分辨显微成像技术是细胞生物学中研究细胞器结构、相互作用和蛋白质功能的强大工具,其具有突破光学衍射极限的分辨能力,从纳米尺度上为细胞生物学提供了新的分析手段,对生命科学相关领域具有重大意义。然而,受衍射极限的影响,超分辨显微镜的轴向分辨率相比于横向分辨率要更难以提高,这导致实现细胞结构亚百纳米分辨率的三维成像更为困难。从受激辐射损耗显微术和单分子定位显微术这两种主流技术出发,对目前存在的多种三维成像技术进行了原理介绍和特点分析,最后对其未来发展方向进行了展望。