体外受精卵母细胞浆内单精子注射-胚胎移植患者血清和卵泡液中25-羟维生素D表达水平及与妊娠结局相关性研究

目的:分析体外受精卵母细胞浆内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)患者血清和卵泡液中25-羟维生素D水平及与妊娠结局的相关性。方法:回顾性分析接受IVF/ICSI-ET的500例患者资料,根据患者血清和卵泡液中25-羟维生素D[25(OH)D]水平将全部患者划分为血清正常组(n=346)与血清缺乏组(n=154)、卵泡液正常组(n=253)与卵泡液缺乏组(n=247),对比两组患者一般资料与妊娠结局,分析血清25(OH)D与卵泡液25(OH)D水平的相关性,血清、卵泡液25(OH)D水平与患者妊娠结局的相关性,Logistic分析血清、卵泡液25(OH)D水平与患者妊娠结局的关系,计算血清、卵泡液25(OH)D水平对于不良妊娠结局的预测Cut-off值。结果:血清缺乏组着床率、成功妊娠率、成功分娩率、血清25(OH)D水平均低于正常组(均P<0.05),卵泡液缺乏组着床率、成功妊娠率、成功分娩率、血清25(OH)D水平均低于正常组,早期流产率高于正常组(均P<0.05);血清与卵泡液25(OH)D水平呈高度正相关(P<0.05);血清25(OH)D水平和卵泡液25(OH)D水平均与妊娠结局分级呈中度负相关(P<0.05);Logistic分析可见,血清25(OH)D水平、卵泡液25(OH)D水平均为妊娠结局的保护因素(OR<1,P<0.01);血清25(OH)D水平与卵泡液25(OH)D水平对于IVF/ICSI-ET患者不良妊娠结局均具有中等预警价值,血清25(OH)D<24.305 ng/ml、卵泡液25(OH)D<22.855 ng/ml提示IVF/ICSI-ET患者不良妊娠结局。结论:IVF/ICSI-ET患者血清和卵泡液中25(OH)D水平及与妊娠结局的具有相关性,血清与卵泡液中25-羟维生素D表达水平具有明确相关性,血清与卵泡液中25-羟维生素D表达水平较高为理想妊娠结局的保护因素,对于IVF/ICSI-ET患者应注意检测25-羟维生素D的表达水平,低于预警值时应及时补充,以为理想妊娠结局提供必要保障。

受精卵注射CRISPR/Cas9系统制备基因编辑子午岭黑山羊技术体系的建立

受精卵注射CRISPR/Cas9系统是制备基因编辑动物的有效方法,其中受精卵收集效率、显微注射胚胎存活率及胚胎移植受体妊娠率是关键影响因素.以子午岭黑山羊为研究对象探讨了情期内不同时间点放置CIDR对超数排卵的影响;分析了胚胎供体和受体发情停止时间差异对胚胎移植妊娠率的影响;设计了3个打靶肌肉生长抑制素基因(MSTN)的小向导RNA(sgRNA),并优化了CRISPR/Cas9系统显微注射参数.结果表明,胚胎供体发情停止后第4天放置阴道栓可有效提高黄体数(15.25±3.69)和受精卵数量(13.875±4.015);利用微量注射泵将Cas9mRNA(60 ng/μL)和打靶MSTN基因的sgRNAs(60 ng/μL)混合液注射到受精卵胞质内,注射参数Pi,Ti和Pc分别为300,0.5和60,注射24 h后胚胎分裂率为76.79%.胚胎移植时受体发情结束时间晚于供体发情结束时间12~16 h妊娠率最高(38.46%).本研究共得到19个存活的个体,经TA克隆测序分析,所有个体MSTN打靶位点上均发现碱基的插入或缺失.综上,本研究以子午岭黑山羊为例,建立了受精卵注射CRISPR/Cas9系统制备基因编辑山羊的技术体系,为利用CRISPR/Cas9技术进行山羊的遗传改造奠定了技术基础.

超排处理山羊获可注射受精卵技术应用中的八个问题

据多年的实验研究和生产应用表明：超排处理山羊是获得可注射和胚胎分割的受精卵最为有效技术途径；如在单个羊只上获得胚胎的数量质量、在大批量胚胎的发育同期性、在获得胚胎的自由性、技术超作可行性等方面，该技术途径比其它技术途径（自然发情配种、人工诱导取卵、分离卵泡体外培养等）都有明显的优越性。

超排处理山羊获可注射受精卵技术应用中的八个问题

据多年的实验研究和生产应用表明:超排处理山羊是获得可注射或胚胎分割的受精卵最为有效的技术途径;如在单个羊只上获得胚胎的数量质量、在大批量胚胎的发育同期性、在获得胚胎的自由性、技术超作可行性等方面,该技术途径比其它技术途径自然发情配种、人工诱导取卵、分离卵泡体外培养等都有明显的优越性。

心脏过表达人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型的建立

目的建立心脏过表达人源PRKAG2(G100S)的转基因小鼠模型,为进一步研究该人源基因点突变对小鼠心脏发育、形态和功能维持的作用奠定基础。方法克隆人源基因PRKAG2并构建点突变质粒,将人源PRKAG2(G100S)插入α肌球蛋白重链(α-MHC)启动子下游,构建转基因表达载体。选用C57BL/6J小鼠为遗传背景,通过显微注射法建立人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型。采用实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法检测人源PRKAG2(G100S)的表达。结果经过回交繁育后建立了2个品系的心脏特异表达人源PRKAG2(G100S)的转基因小鼠品系F2代,并通过qPCR、蛋白质印迹法检测,确认了转基因小鼠心脏组织中人源PRKAG2(G100S)在mRNA和蛋白水平存在过表达,且该突变能在转基因小鼠中稳定传代。结论本研究成功建立了心脏特异表达人源PRKAG2(G100S)转基因小鼠模型,人源PRKAG2(G100S)基因在心脏组织的过度表达在小鼠心脏发育和功能维持中的作用需要进一步深入研究与探讨。

一种红色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立广泛表达红色荧光蛋白(RFP)的转基因小鼠,便于组织和细胞移植研究.方法:把DsRed基因片段插入到pCAGGS载体的强启动子下游构建转基因载体pCAG-DsRed.经细胞转染验证,受精卵原核注射,建立红色荧光蛋白转基因C57BL/6小鼠.PCR鉴定转基因小鼠的基因型;红色荧光蛋白在组织中的表达情况,则通过荧光显微镜检测小鼠各组织器官冰冻切片.结果:pCAG-DsRed载体可以在真核细胞中表达RFP,经基因型分析和表型观察,得到两只红色荧光蛋白的首建鼠.经荧光显微镜观察各组织冰冻切片发现红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,其中在神经系统和肌肉组织中表达量较高.结论:成功建立了一种红色荧光蛋白转基因小鼠,红色荧光蛋白在转基因小鼠的神经系统和肌肉组织等中高表达.

PD-L1转基因小鼠的建立及其脊髓损伤后的运动功能恢复

目的:建立广泛表达PD-L1的转基因小鼠,并且评价转基因小鼠脊髓损伤后的运动功能恢复情况。方法:克隆小鼠PD-L1基因编码区的cDNA,经测序正确后,将PD-L1基因cDNA插入到pCAGGS质粒中,构建pCAG-PD-L1转基因载体;经C57BL/6小鼠受精卵原核注射,建立PD-L1转基因小鼠;PCR鉴定转基因小鼠的基因型;以流式细胞术(FCM)检测转基因小鼠脾脏中T、B淋巴细胞PD-L1的表达情况;免疫组织化学检测转基因小鼠周围组织PD-L1表达情况;RT-PCR检测转基因小鼠神经组织内PD-L1表达;BBB评价转基因小鼠脊髓损伤后运动功能恢复。结果:获得PD-L1转基因小鼠,外源PD-L1基因可以顺利遗传给子代;免疫组织化学、RT-PCR和FCM发现:PD-L1转基因小鼠的神经组织、淋巴组织以及生殖器官中高表达PD-L1;PD-L1转基因小鼠脊髓重度夹伤后,其BBB运动学评分明显高于野生型小鼠(P<0.05)。结论:成功地建立了C57BL/6背景的PD-L1转基因小鼠,且PD-L1基因的高表达促进脊髓损伤后的运动功能恢复。

PiggyBac在转基因小鼠制备中的应用

受精卵雄原核裸DNA注射是目前制备转基因小鼠的主要技术,而转基因表达成功率低是这种技术的主要缺点。piggyBac转座子系统已被报道用于制备转基因小鼠,但这一方法是否能够提高转基因的表达成功率尚不清楚。为此,我们利用毛色基因agouti为报告基因,采用piggyBac转座子系统以C57/BL6小鼠为背景进行转基因小鼠的制备。结果表明,将piggyBac转座酶cRNA和转基因载体进行受精卵雄原核共注射后,转基因阳性率为18.4%,转基因表达率为88.89%,显著高于单独进行转基因载体DNA受精卵雄原核注射法。同时,利用agouti基因作为报告基因,可根据毛色变化直接对表达阳性的转基因小鼠进行初步筛选,提高了筛选效率。