蟑螂变应原基因的免疫学筛选及序列分析

目的 探讨从美洲蟑螂cDNA表达文库中获得的变应原基因对过敏性疾病的治疗价值。方法 用生物素 链霉亲合素系统 ,使用蟑螂过敏病人血清IgG4,对已构建的美洲蟑螂cDNA表达文库进行免疫学筛选 ,并对阳性克隆进行序列测定及同源性分析。结果 从美洲蟑螂cDNA文库筛选出 3个阳性克隆 ,同源性分析显示 ,3号克隆核苷酸序列及推导的氨基酸序列与美洲蟑螂主要变应原CrPI高度同源 ,一致性达 99% ,1、2号克隆与已知变应原无显著同源性 (score <2 0 0 ) ,提示其为新的蟑螂变应原基因 ,其中 1号为编码核糖体蛋白S12 ,2号为编码Rab11蛋白。结论 3号为克隆编码美洲蟑螂主要变应原CrPI,另外 2个克隆为新的蟑螂变应原基因 ,对这些基因的进一步亚克隆表达 。

空调隔尘网尘螨变应原基因检测

目的检测空调污染隔尘网尘螨变应原的基因种类。方法采集居民空调隔尘网灰尘样品20份,分别提取总基因组DNA,并以此为模板分别用粉尘螨和屋尘螨1、2、3类变应原基因(ProDerf1、ProDerp1、Derf2、Derp2、Derf3、Derp3)特异性引物PCR扩增尘螨变应原基因,PCR产物纯化后连接pUCm-T载体,并转化E.coliDH-5α感受态细胞,涂LB板(Amp+),37℃过夜培养,随机挑取单克隆菌落进行PCR验证,阳性克隆测序并进行序列比对分析。结果共20份样品,17份检测出螨性变应原基因,同时含有ProDerf1、ProDerp1、Derf2和Derp2变应原基因6份,其余阳性样品均含有粉尘螨和(或)屋尘螨1、2类变应原基因中的一种或多种。结论芜湖市区居民空调隔尘网中含有可能引起过敏性疾病的粉尘螨和屋尘螨1、2类变应原。

尘螨变应原基因ProDer f1突变体的制备与表达

目的制备粉尘螨1类变应原基因ProDer f 1的突变体并原核表达。方法 PCR扩增ProDer f 1基因,DNaseⅠ酶切后回收≤100bp的基因片段。回收的基因片段进行3轮无引物PCR,并以此为模板用ProDer f1基因的特异性引物进行PCR,切胶回收与ProDer f1基因大小相当的片段,连接pUCm-T载体后测序。DNAMAN软件分析突变基因,筛选理想的突变体,连接pET-28a(+)载体后转入E.coli BL21感受态细胞进行原核表达,切胶回收表达产物并进行Western blot验证。结果得到ProDer f1基因的突变体C1并成功表达嵌合蛋白,SDS-PAGE电泳分析该蛋白分子质量单位为35ku,与预期值相符;Western blot显示该嵌合蛋白能与粉尘螨变应原致敏兔血清中特异性抗体结合。结论成功制备ProDer f1基因的突变体且能在原核表达系统中表达嵌合蛋白。