美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及变应原活性测定

目的克隆美洲大蠊(Periplaneta americana)精氨酸激酶(arginine kinase,AK)基因并表达、纯化具有变应原活性的重组AK。方法提取美洲大蠊总RNA,设计特异引物,通过RT-PCR克隆美洲大蠊AK基因目的片段,测序后将该片段克隆入原核表达载体pET-28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获重组AK。用镍离子(Ni2+)亲和层析柱纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组AK表达情况。用蛋白质印迹分析(Western blotting)(变性条件)和ELISA(非变性条件)检测重组AK变应原与过敏患者血清IgE结合活性,并以健康人血清为对照。结果测序结果表明,AK基因含有1068bp的开放阅读框,编码356个氨基酸(登录号为EU429466)。与Gen Bank公布的序列(登录号为AY563004)比较同源性达99.9%。SDS-PAGE分析表明,该变应原基因在E.coli中主要以可溶形式高水平表达,相对分子质量约为Mr45000。重组变应原AK在变性与非变性条件下,与过敏患者血清IgE均具有良好的结合活性,与健康人对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论获得了具有变应原活性的重组美洲大蠊精氨酸激酶。

多主枝孢霉重组变应原Cla h8的制备及其免疫活性鉴定

目的:通过基因工程手段,获得重组多主枝孢霉变应原蛋白Cla h8,有利于进行变应原的标准化,为标准化抗原的临床特异性诊断与治疗奠定基础。方法:从多主枝孢霉菌体中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增Cla h8编码基因,将其连入pET-19b载体。转入大肠杆菌BL21 Star(DE3)pLysS,经诱导表达后,进行提纯复性,用Western blot和Dot-blot检测其免疫活性。结果:重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白可以与多主枝孢霉过敏患者的血清中IgE和IgG抗体特异性结合,与天然蛋白具有相似的免疫活性。结论:制备并获得了具有生物学活性的可溶性重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白,可用于多主枝孢霉变应原的标准化,克服天然提取物的非单一性及标准化难的障碍。

螨变应原注射液体外效力评价方法的建立及验证

目的:针对铝佐剂吸附的螨变应原注射液缺乏有效的生物效力评价方法的现状,探索用基于ImmunoCAP仪的荧光酶联免疫分析方法(ImmunoCAP法)作为该制品体外效力评价方法可行性,以促进该制品质量标准的提高。方法:利用ImmunoCAP法测定螨变应原注射液对过敏病人血清中IgE的抑制率(又称为变应原活性),作为该制品效力评价的检测指标。研究中分析了该方法的特异性;探索了孵育时间、温度、血清稀释度、变应原浓度等条件对抑制率的影响;验证了该方法的精密性;测定了13批维持剂量螨变应原注射液的总变应原活性和上清游离变应原活性。结果:应用ImmuonCAP法测定维持剂量螨变应原注射液对过敏病人血清IgE抑制率,具有较好的特异性;维持剂量制品对血清中特异性IgE的抑制率与变应原浓度具有明显的量效反应关系;该法具有很好的精密性,RSD最大不超过5%;13批维持剂量制品总变应原对血清中IgE抑制率均大于50%;上清中游离变应原对血清中IgE抑制率均不高于20%。结论:ImmunoCAP法可用于铝佐剂吸附的螨变应原注射液的体外效力评价,重复性好,精密度高,操作简便。