htrA、clpP基因缺失对变异链球菌生长影响的初步观察

目的：研究htrA、clpP基因缺失对变异链球菌生长情况的影响。方法：采用浊度法测定变异链球菌标准株、htrA单基因缺陷株、clpP单基因缺陷株及htrA—clpP双基因缺陷株生长6h中每小时的吸光度，采用MTT实验测定4种菌株的不同时间甲臌吸光度变化情况并探究其与平板计数活菌量之间的关系。结果：在正常营养条件下，浊度法1．6h及MTr法2、4h及6h变异链球菌标准株的生长快于htrA、htrA—clpP缺陷株（P〈0．01）；浊度法1-6h及MTT法1-3hclpP缺陷株生长快于其他两种缺陷株（P〈0．01）；变异链球菌标准株、htrA缺陷株及htrA—clpP缺陷株1～4h、clpP缺陷株1-3h甲脱吸光度与活菌量呈正相关（r分别为0．860、0．761、0．790及0．773，P〈0．05或P〈0．01）。结论：htrA、clpP单独或同时缺失可抑制变异链球菌的生长，MTT实验可在一定时间和一定菌数范围内反映标准株与3种缺陷株的活菌数。

htrA和clpP基因缺失对变异链球菌铁代谢的影响

目的探讨高温需要蛋白A(htrA)和酪蛋白裂解酶P(clpP)单基因缺失对变异链球菌铁代谢的影响。方法采用浊度法测定变异链球菌标准株、htrA缺陷株和clpP缺陷株在0.1、0.2及0.3mmol/L铁限制条件培养基中培养24h的吸光度(A)值,并测定加入外源性铁或标准株分别与2种缺陷株在0.3mmol/L铁限制培养基中混合培养24h后的A值。结果与标准株相比,htrA缺陷株在浓度0.3mmol/L时A值差异有统计学意义(P<0.01);clpP缺陷株在0.2mmol/L时A值差异即有统计学意义(P<0.05),并且其值随铁螯合剂浓度的增加而减小。加入FeSO4培养24h,htrA缺陷株与标准株A值差异无统计学意义(P>0.05);clpP缺陷株的A值低于标准株(1.002±0.014 vs 1.325±0.010,P<0.05)。与标准株按1∶1比例混合培养24h,htrA缺陷株与其单独生长时的A值的差异无统计学意义(P>0.05);clpP缺陷株的A值高于其单独培养时的A值(10.878±0.005 vs 0.664±0.006),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 htrA和clpP基因分别在一定程度上影响变异链球菌的铁代谢。

副猪嗜血杆菌血清7型crp基因缺失株的部分生物学特性

副猪嗜血杆菌(HPS)是引起猪格拉瑟病(Glasser’s disease)的病原菌,给全球和中国规模化养猪业造成了重大经济损失。副猪嗜血杆菌血清型众多,其中血清7型是近年来分离比例越来越高的血清型,也是危害越来越严重的血清型。crp是最重要的系统调控因子之一,在细菌感染过程中对细菌适应环境变化起着至关重要的作用。为了筛选副猪嗜血杆菌血清7型crp基因缺失弱毒株,采用自然转化法构建了副猪嗜血杆菌血清7型临床分离株HPS7的crp基因缺失株,对HPS7及其crp基因缺失株的生长特性、生物膜形成、抗药性、毒力等进行了研究。结果表明,HPS7的crp基因缺失后,生长显著减慢,自凝速度减慢,生物膜形成能力明显减弱,对大部分抗生素的抗性降低,对豚鼠的毒力降低。以上结果说明crp基因对HPS7的生长、抗药性、毒力均有明显影响。本研究结果为筛选副猪嗜血杆菌血清7型弱毒株提供了参考。

KIT杂合大片段缺失导致斑驳病一家系的临床表型

目的鉴定一个斑驳病家系的致病基因突变。方法收集斑驳病患者及其家系成员的临床资料,采集外周血,进行全外显子组测序。通过qPCR验证目的基因的缺失;采用gap-PCR结合Sanger测序法确定具体缺失的大小以及位点。结果在先证者4号染色体上存在约1.74 Mb的杂合大片段缺失突变,其中包括了全部KIT(斑驳病的致病基因)。该缺失在家系中呈基因型-表型共分离,在dbSNV数据库中未见该区域的缺失报道。该缺失是目前报道的最小的因KIT全长缺失而导致斑驳病表型的片段缺失。结论KIT缺失是导致该家系斑驳病表型的原因。

利用Cre/loxP系统构建无标记的htrA基因缺失的变链菌突变株

目的:利用Cre/loxP位点特异性重组系统构建口腔变异链球菌htrA基因缺陷株,并删除选择标记。方法:PCR扩增变链菌的htrA基因片段并克隆到pGEM-T-EasyTA载体。随后插入卡那霉素(Km)抗性基因盒(loxP-Km-loxP)并替换htrA基因的部分序列,使htrA基因失活,构建出htrA基因缺失的同源重组载体pIB△htrA-Km。将该质粒电转化变链菌标准株,抗生素筛选出发生同源重组的菌株,再用含cre基因的热敏质粒pCrePA电转化,删除Km抗性基因。在限制性温度下培养,消除质粒pCrePA,获得无标记的变链菌htrA基因缺陷株,经PCR及DNA测序鉴定。结果:PCR及DNA测序分析证明htrA基因的部分序列及Km抗性基因均被删除,该部位只留下一个loxP位点。结论:成功构建出了变链菌htrA基因缺失突变株,并删除了抗性标记,为进一步研究htrA基因缺失对变链菌致龋毒力的影响奠定了基础。

非小细胞肺癌组织中p15基因纯合性缺失和血管内皮生长因子过表达的研究

目的:探讨p15基因纯合性缺失和血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)过表达的相关性及两者与非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)生物学特征之间的关系。方法:提取DNA,采用PCR技术,分别对97例NSCLC组织和20例癌旁正常组织进行p15基因纯合缺失检测;提取组织RNA,采用RT-PCR技术分析VEGF基因表达水平。结果:NSCLC组织中p15基因纯合缺失率和VEGF表达率分别为44.3%(43/97)和66.0%(64/97),显著高于癌旁正常组织的5%(1/20)和10%(2/20),P<0·05。p15基因纯合缺失与TNM分期(P=0·001)和淋巴结转移相关(P=0·018),而与组织学类型无相关性,P=5·731;VEGF过表达与TNM分期和淋巴结转移相关,P值均<0·01;而与组织学类型无相关性,P=2·113。p15基因纯合缺失与VEGF表达呈正相关。结论:p15基因纯合缺失和VEGF基因过表达可能在NSCLC的发生及恶性进展中发挥一定的作用。

人Elongator复合物Elp3亚基基因可显著补偿酵母elp3缺失菌株的生长缺陷

从HeLa细胞中分离的人的Elongator复合物在组成及与RNAPⅡ的作用方式上与酵母的E- longator复合物十分相似,但对其功能研究极少。为了研究人的Elongator复合物催化亚基Elp3的功能,将人elp3等基因转入酵母elp3基因缺失的突变菌株(elp3Δ菌株),并对转化菌株进行功能互补实验和ssa3和pho5基因表达分析,结果表明人elp3基因可显著恢复突变菌株对高温和Caffeine的敏感性,在低磷条件下显著补偿了突变株pho5基因表达延迟的缺陷,并可在热激条件下提高ssa3基因的表达。含酵母elp3非HAT区和人elp3 HAT区的融合yhelp3对上述缺陷有着更强的补偿能力。而HAT区催化结构域缺失的yhelp3HAT没有任何补偿能力,表明人Elp3亚基可能与酵母的该亚基功能相似,人Elp3的HAT活性也为其行使功能所必需。

肝特异性胰岛素样生长因子I基因缺失鼠原发性乳腺癌模型的建立

目的 在肝特异性胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF Ⅰ )基因缺失鼠体内建立稳定的原发性乳腺癌模型 ,为进一步探讨血清中IGF Ⅰ水平对乳腺肿瘤的发生可能产生的影响建立研究平台。方法 实验中所用的肝脏特异性IGF Ⅰ基因缺失 (LID)小鼠 ,其循环中IGF Ⅰ水平仅为正常小鼠 (对照组小鼠 )的 2 5 %。用化学致癌剂 7,12 二甲基苯蒽(DMBA)诱导原发性乳腺肿瘤。结果 与对照组相比 ,LID鼠乳腺肿瘤的潜伏期均明显延长 ,LID小鼠可触及的乳腺肿瘤发病率明显下降 (2 6 3% /5 5 8% ) ,其肿瘤的出现也明显延迟 [(74 0± 1 2 )d/(5 9 5± 1 1)d]。对照组 6 0 %小鼠有 2个或者 2个以上肿瘤 ,而LID鼠仅 30 %有 1个以上肿瘤。结论 在致癌剂DMBA诱导的乳腺肿瘤模型中 ,IGF Ⅰ作为一种危险因子 。

采用定点基因缺失突变技术在大肠杆菌中分泌鲑鱼生长激素

目的：为获得与天然鲑鱼生长激素一致的基因工程产物，对已构建的鲑鱼生长激素基因分泌型表达质粒ｐＯｓＧＨ１５３进行改造，删除所编码表达产物氨基端多余的９个碱基。方法：采用ＰＡＬＴＥＲ系统进行寡聚核苷酸指导下的基因定点缺失突变。突变质粒ｐＯｓＧＨ１５８经限制性酶切图谱及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交分析加以证实。结果：含有表达质粒ｐＯｓＧＨ１５８的大肠杆菌株经ＩＰＴＧ诱导后提取周质蛋白。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及免疫印迹分析表明：周质表达产物具有与天然ｓＧＨ免疫活性和分子量一致的特性，其分子质量约为２３ｋｕ。结论：应用ＰＩＮ－Ⅲ－ｏｍｐＡ ２分泌型载体系统和ＰＡＬＴＥＲ突变系统构建鲑鱼生长激素基因在大肠杆菌表达载体的方法，可作为原核系统分泌型高效表达的模型。

基因缺失猪繁殖与呼吸综合征病毒河北株HB-Xt1的分离鉴定及其生长特性

近年来河北省高致病性PRRS病例屡屡发生,为了弄清本地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）毒株的分子特征和生物学特性,本实验室从河北省某猪场疑似PRRS死亡仔猪的脾脏和淋巴结混合物内分离到的1株高致病性PRRSV,明确了其体外培养特性,以便为进一步研究该毒株的致病性及相应的弱毒疫苗奠定基础.

伪狂犬病病毒变异株的致病性、分子特征及基因缺失疫苗的研制

仇华吉研究员首先介绍了伪狂犬病的基本情况和危害,他介绍说伪狂犬病是一种严重危害养猪业的一种烈性传染病,感染宿主广泛,除了人和马都可感染此病,不同日龄的猪均可感染,可造成严重的经济损失.

鸡白痢沙门菌htrA基因缺失株的构建及其相关生物学特性研究

为研究丝氨酸蛋白酶HtrA对鸡白痢沙门菌在巨噬细胞内生存的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了鸡白痢沙门菌(ATCC19945) htra基因缺失突变株(ATCC19945Δhtra),通过测定其巨噬细胞内存活能力、应激条件实验,探究Htr A蛋白在鸡白痢沙门菌致病过程中的作用。结果显示,缺失株ATCC19945Δhtra与野生型菌株和回复菌株相比,其生长速度、生化特性无明显差异,但其巨噬细胞内存活能力显著降低。应激环境试验结果表明,htra基因缺失后鸡白痢沙门菌对pH、热和H_2O_2氧化应激的敏感性增加,在蛋清中生存能力下降,生物被膜形成能力显著下降。本研究为进一步阐释鸡白痢沙门菌的胞内存活机制、疫苗开发奠定基础。

利用框内缺失法构建变异链球菌srtA基因缺失株

目的利用框内缺失法,通过IFDC2基因盒及融合聚合酶链反应(PCR)、同源重组技术构建变异链球菌UA159菌株srt A基因缺失株。方法 PCR扩增变异链球菌UA159菌株srt A基因上下游同源片段及IFDC2基因盒,将这些片段连接、转化入UA159,替换srt A基因同源片段,筛选、鉴定红霉素抗性克隆;PCR扩增、连接UA159 srt A基因上下游同源片段,将连接片段转化入前述红霉素抗性克隆中替换IFDC2同源片段,筛选、鉴定抗苯丙氨酸类似物p-chloro-phenylalanine(p-Cl-Phe)克隆。结果 PCR、琼脂糖凝胶电泳及DNA测序结果均证明srt A基因编码区被完全删除,上下游片段无缝连接,成功构建UA159 srt A基因缺失株。结论本研究成功构建了无标记的变异链球菌UA159 srt A基因缺失株,为进一步研究该基因在生物膜中的作用及其调控机制奠定了基础。

基因缺失,顽强猎豹依然逆袭生长

猎豹是哺乳动物中最优秀的物种，它们身材修长，快如闪电，能以每小时113千米的速度飞奔，堪称大型哺乳动物中的短跑冠军。但它们的整体数量已从一个多世纪前的10万只，锐减至目前的不足8000只。对它们数量减少的原因，生物学界一直众说纷纭……

一种多值编码遗传算法的缺失基因复现方法

与二值编码遗传算法相比,基因缺失问题对多值编码遗传算法的全局搜索性能影响比较大。提出一种缺失基因复现和存活的变异方法,即根据字符集中的字符在种群中的缺失作为预选变异基因集,然后对待变异个体集进行预变异;选择高适应度个体的对应变异基因和基因位,使其在原待变异个体集中扩散。将该方法应用到多重选择背包问题的遗传算法中,通过仿真实验验证了该方法的有效性。

布鲁氏菌vceA基因缺失株的构建及生物学特性研究

试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。

布鲁氏菌分泌蛋白BMCO基因缺失株的构建及生物学特性研究

【目的】试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1800 V电压、400Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】试验成功获得片段大小为522、539、1054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。

鸡白痢沙门菌ssaV基因缺失株的构建及其生物学特性分析

为探究ssaV基因对鸡白痢沙门菌致病性的影响,利用同源重组技术,以pKD3质粒为模板,设计同源臂,扩增外源线性DNA片段,将该片段电转化入含有pKD46的鸡白痢沙门菌C79-13,丢失pKD46后,获得重组菌C79-13ΔssaV∶∶Cm,将pCP20导入该重组菌,通过筛选获得ssaV基因缺失株C79-13ΔssaV,同时构建其回补株C79-13ΔssaV(pBR322-ssaV),并对突变株C79-13ΔssaV的生长特性和生化特性、遗传稳定性及毒力等基本生物学特征进行分析。PCR扩增和测序结果显示,成功构建了缺失株C79-13ΔssaV,野生株C79-13、缺失株C79-13ΔssaV和回补株C79-13ΔssaV(pBR322-ssaV)呈现出一致的生长特性和生化特性,突变株C79-13ΔssaV的遗传稳定性良好,其在雏鸡体内的定殖能力降低,且口服攻毒后,缺失株C79-13ΔssaV对雏鸡半数致死量(LD50)至少是野生株(C79-13)的100倍。以上结果表明,ssaV基因与鸡白痢沙门菌的致病性相关,其缺失会明显降低鸡白痢沙门菌的毒力。

产前诊断中采用拷贝数变异测序技术检测胎儿DMD基因缺失或重复的效能

目的评估产前诊断中采用低深度高通量全基因组拷贝数变异测序(CNV-seq)技术对胎儿DMD基因缺失或重复的诊断效能。方法对2018年1月至2023年7月于云南省第一人民医院行产前诊断的34544例胎儿的CNV-seq检测结果进行回顾性分析,共纳入156例胎儿,包括:有假性肥大型进行性肌营养不良[DMD;包括表型较轻的贝氏肌营养不良(BMD)]生育史或家族史的胎儿125例;无DMD/BMD生育史或家族史但因其他指征行产前诊断检出DMD基因缺失或重复的胎儿31例。采用多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术对胎儿样本进行检测验证,对CNV-seq和MLPA结果进行一致性检验,获得CNV-seq对胎儿DMD基因缺失或重复的检测效能。结果与MLPA相比,CNV-seq对胎儿DMD基因缺失或重复的检出总符合率为92.3%(144/156),敏感度和阳性预测值均为88.2%,特异度和阴性预测值均为94.3%,漏检率为3.8%,Kappa系数为0.839。有DMD/BMD生育史或家族史的胎儿中,MLPA共检出20例缺失和6例重复,其中4例缺失和2例重复因变异片段<100 Kb被CNV-seq漏检。无DMD/BMD生育史或家族史的胎儿中,CNV-seq检出缺失占42%(13/31),重复占58%(18/31),重复占比高于有DMD/BMD生育史或家族史的胎儿,其中3例位于第42~67号外显子(可能致病),9例覆盖DMD基因5’或3’末端,均包含第1或第79号外显子(临床意义未明),其余6例CNV-seq检出重复片段位于chrX:32650635_32910000(临床意义未明),但MLPA检测结果均为阴性。结论CNV-seq可有效检出胎儿DMD基因缺失或重复,但存在少量漏检风险,结果需MLPA验证。CNV-seq检测到chrX:32650635_32910000区域重复及检出覆盖DMD基因5′端或3′端重复的变异可能并不致病。

猪伪狂犬病病毒变异株传代致弱JS18-150株的获得与鉴定

为获得安全性良好、免疫原性高的变异株弱毒苗,采用鸡胚成纤维细胞(CEF)传代培养的方法对猪伪狂犬病病毒流行毒株JS18株进行传代,最终获得JS18-150株,随后通过PCR鉴定、测序、致病力试验和免疫效力试验对JS18-150株的体外生长特性、安全性和免疫原性进行初步研究。试验结果显示,在CEF上连续传代后,JS18株的gI、gE、US9基因缺失,获得的JS18-150株毒力已致弱,在CEF上适应性显著提高,与JS18株生长动力学相似;将JS18-150株以107.0TCID50/mL接种仔猪,所有仔猪均未观察到任何临床症状,且体温均未超过40.5℃;JS18-150株以106TCID50/mL接种仔猪后能保护仔猪有效抵御JS18株和HBZL05株的攻击。结果表明,JS18-150株对仔猪安全性良好,可作为PRV弱毒疫苗研制的候选毒株。