变异链球菌LuxS突变株的构建及其耐酸性的测试

目的:把构建好的含有luxS基因两侧同源序列的重组质粒转入变异链球菌进行luxS的敲除以形成luxS突变株,同时测试变异链球菌失去luxS基因后在pH 3.0酸性环境中的生长情况。方法:把含有luxS基因两侧同源序列的重组质粒(pMD-19TUKD)转化入变异链球菌UA159中,利用同源重组,等位基因交换进行luxS基因敲除,再对此突变株进行PCR的检测,利用测试A值、梯度稀释和平板计数法,对变异链球菌luxS突变株和野生型的变异链球菌在pH 3.0酸性环境下生存情况进行比较。结果:成功的构建了变异链球菌luxS的突变株,并且变异链球菌失去luxS基因后,在酸性环境下的生存能力相对于野生型的变异链球菌低。结论:LuxS基因对变异链球菌的耐酸性起着重要作用。

变异链球菌LuxS基因缺陷突变株的构建及其生物膜结构的初步观察研究

目的:通过同源重组法构建变异链球菌LuxS基因缺陷突变菌株,比较其与变异链球菌UA159标准株在生物膜形成上的差异。方法:运用基因同源重组方法将氯霉素抗性基因(Cmr)与LuxS基因上下游区域的2个基因片段按一定顺序重组到PUC载体的多克隆位点中,构建出带氯霉素抗性标志的重组质粒,将载体质粒转化到含完整LuxS基因的变异链球菌UA159中,利用氯霉素抗性筛选出LuxS基因缺陷的突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)和哈氏弧菌发光实验进行检测。以釉质磨片为载体,在扫描电镜下观察上述两菌株含有20 g/L葡萄糖、20 g/L蔗糖的乳酪消化胨酵母(TPY)液体培养基中形成24 h的生物膜。结果:PCR基因扩增结果显示:突变株LuxS基因已被Cmr基因完全替换,成功的构建了变异链球菌LuxS基因突变株,并且突变株不能诱导哈氏弧菌BB170的生物发光。当用葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌UA159标准株和LuxS基因突变株所形成的生物膜表现型未见明显差异;而用蔗糖作为补充糖源时,两菌株所形成的生物膜有明显不同,UA159生物膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株生物膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落。结论:成功构建出LuxS基因缺陷的变异链球菌突变株,与变异链球菌UA159标准株其生物膜结构发生改变,提示LuxS会影响变异链球菌生物膜的形成。

变异链球菌LuxS基因突变株生物被膜结构的电镜观察

目的:探讨变异链球菌IngbrittC(血清C型)国际标准株与LuxS基因缺失的变异链球菌突变株之间生物被膜的形成差异。方法:分别将变异链球菌标准株和LuxS基因突变株接种于含有2%葡萄糖、2%蔗糖的乳酪消化胨酵母(TPY)液体培养基中,以牙釉质磨片为载体,于扫描电镜下观察形成24h的上述两菌株生物被膜。结果:(1)当以葡萄糖作为补充糖源时,变异链球菌标准株和LuxS基因突变株所形成的生物被膜表现型未见明显差异;(2)当以蔗糖作为补充糖源时,两菌株所形成的生物被膜有明显的不同,标准株生物被膜相对平滑均质,而LuxS基因突变株的生物被膜呈松散的蜂房状,基质间有较大的间隙,形成较大的团簇状菌落;(3)加入标准株的无菌体上清液可以使LuxS基因突变株的生物被膜表型部分恢复正常,提高LuxS基因突变株形成生物被膜的能力。结论:变异链球菌标准株和LuxS基因突变株均能形成生物被膜,但LuxS基因突变株的生物被膜结构发生改变;依赖于LuxS的群体感应系统会影响变异链球菌生物被膜的形成。

LuxS基因缺失对变异链球菌生物学性状的影响

目的:观察LuxS基因突变对变异链球菌生物性状的影响。方法:将变链菌标准株和LuxS突变株分别培养于TSA、TSA-Cmr、BHI培养基培养48 h,通过菌落形态观察、常规生化检测、革兰染色涂片观察和生长曲线,比较两种菌株的生长特性;体外建立LuxS基因突变株和标准株的生物被膜模型,结晶紫染色,观察比较两菌株形成生物被膜的能力。结果:在含氯霉素的TSA-Cmr固体培养基中增塑,标准株基本不能生长,而突变株的生长状况基本正常。在不含氯霉素的TSA固体培养基中培养,两种菌株的菌落形态没有明显差别,革兰染色镜下观察,可见标准株菌体呈长链状排列且相互缠绕,而突变株菌体多呈短链状排列,形成长链的较少。生长曲线观察发现:两菌株在生长模式上基本一致,均呈典型的"S"型曲线,只是在进入生长的稳定期后,两者在细菌饱和度上有一定差异,即11.5～22.5 h之间各时间点标准株的A值均明显高于LuxS突变株(P<0.05)。在BHI培养基中两菌株均能形成生物被膜,但结构存在差异:标准株形成光滑且均匀分布的生物被膜,而突变株的生物被膜形态较粗糙。结论:LuxS基因突变对变异链球菌的生长以及生物被膜形成能力等生物学性状有一定影响。

变异链球菌luxS基因对牙菌斑生物膜形成的影响研究

目的敲除变异链球菌中的luxS基因,构建luxS突变株,测试变异链球菌失去luxS基因后形成牙菌斑生物膜的能力。方法把luxS基因敲除重组质粒转入变异链球菌UA159中,得到转化菌,在含有卡拉霉素的培养基中进行筛选,得到变异链球菌luxS基因突变株,并利用聚合酶链式反应(PCR)和哈氏弧菌发光实验对变异链球菌luxS突变株进行检测,通过扫描电镜,对不同时间段变异链球菌luxS突变株和变异链球菌UA159在BHIS培养液(含1%蔗糖的脑心浸液)和BHIG培养液(含1%葡萄糖的脑心浸液)中形成的生物膜进行比较。结果成功的构建了变异链球菌luxS突变株,在BHIS培养液中,变异链球菌luxS突变株形成生物膜的能力比变异链球菌UA159弱,而在BHIG培养液中,二者无显著差异。结论变异链球菌luxS基因对牙菌斑生物膜的形成有重要的影响,并且luxS基因对变异链球菌生物膜的调控是蔗糖依赖型的。

LuxS基因缺失对变形链球菌耐酸性的影响

目的:探讨变形链球菌Ingbritt C(血清C型)国际标准株与LuxS基因缺失的变形链球菌突变株之间耐酸能力的差异。方法:配制相同浓度的变形链球菌标准株与LuxS缺陷株菌悬液,分别在不同pH值(pH3.5～7.0)的BHI液体培养基中培养相同时间后,用紫外分光光度计测定吸光度,比较2种菌株的生长情况;先在轻度酸性环境(pH5.5)中预酸化,再将2种菌株于致死性pH值环境(pH3.0)中培养,比较其适应性耐酸能力。结果:①pH值为6.0～7.0时,2种菌珠在相同pH值条件下生长情况间的差异无显著性(P>0.05),且3组不同pH值条件下细菌生长情况间的差异亦无显著性(P>0.05);②pH值为4.5～5.5时,2种菌株的生长情况的差异有显著性(P<0.05);③在pH值为3.0时,LuxS缺陷株的生存率(0.006 5%)要明显低于标准株的生存率(0.078%),差异有显著性(P<0.05)。④在pH值5.5环境下预酸化后,LuxS缺陷株的生存率(0.747%)约为标准株生存率(8.65%)的1/10。结论:在亚致死性pH值中,变形链球菌标准株与LuxS缺陷株的耐酸能力具有差异,标准株的耐酸能力强于LuxS缺陷株,2种菌株均表现出了适应性耐酸的能力;变形链球菌LuxS缺陷株对酸的敏感性增加,而适应性耐酸能力仍然存在。

LuxS基因缺失对变形链球菌蛋白表达的影响

目的通过双向电泳技术对比研究变形链球菌标准株与LuxS突变株菌体总蛋白质的表达差异,为进一步研究LuxS信号系统对变形链球菌致龋毒力的调控机制奠定基础。方法提取变形链球菌标准株及LuxS突变株的菌体总蛋白质,采用双向电泳技术对比研究两者蛋白质的表达差异,找出差异蛋白点。结果与标准株菌体总蛋白2-DE图谱相比较,LuxS突变株菌体总蛋白2-DE图谱中有61个斑点的蛋白质表达量发生了改变:36个点蛋白质表达量升高,25个点蛋白质表达量降低。结论变形链球菌标准株与LuxS突变株菌体总蛋白存在明显的差异,表现为2-DE图谱蛋白斑点染色的深浅不同,提示LuxS突变株菌体总蛋白发生了量的变化。

变异链球菌hit基因缺陷菌株的构建

目的构建hit基因缺陷型变异链球菌株并验证其细胞周期调控的功能。方法从变异链球菌株ATCC25175中提取基因组DNA,采用PCR扩增技术,将hit基因上下游片段克隆到pFW5质粒(壮观霉素抗性)上以构建重组质粒;利用该菌株天然遗传转化机制,将线性化重组质粒转入由其感受刺激多肽(competence stimulating peptide,CSP)刺激产生变异链球菌感受态中,进行同源重组;再通过壮观霉素抗性筛选,结合PCR产物电泳和Sanger法测序,筛选鉴定hit基因缺陷型变异链球菌株;最后在BHI培养基中培养,检测其生长速率。结果从ATCC25175变异链球菌基因组DNA中,克隆hit基因上游约856 bp、下游约519 bp片段到pFW5质粒的两个多克隆位点区间(MCS⁃I和MCS⁃II),经双酶切和PCR测序鉴定,得到重组质粒pFW5_hit_Up_Down。线性化该重组质粒,转入由CSP刺激产生变链感受态中进行同源重组;再通过壮观霉素BHI培养基多次抗性筛选,hit基因片段的PCR产物电泳和Sanger测序筛选出hit基因缺陷变异链球菌株,该缺陷菌株较其亲本菌株生长更快速(P<0.001)。结论获得具有遗传性状hit基因缺陷变异链球菌株,hit基因产物调控变异链球菌生长周期。

LuxS基因缺失的变形链球菌突变株的构建及鉴定

目的通过同源重组法构建LuxS基因缺失的变形链球菌（Streptococcus mutans）突变株。方法运用基因同源重组方法将红霉素抗性基因（Eym‘）连接到PCR扩增LuxS基因两端区域产生的2个基因片段之间，并共同插入到pUC19载体的多克隆位点中，构建出带红霉素抗性标志的缺失突变载体pUCluxKO。将突变载体转化到含完整LuxS基因的突变受体变形链球菌标准株中，红霉素筛选出LuxS基因缺失的变形链球菌突变株，并经PCR、生物荧光检测及DNA测序鉴定。结果构建的突变载体经限制性内切核酸酶酶切分析显示，产生的条带与设计结果完全一致。PCR方法扩增突变株LuxS和Eym＇基因显示，LuxS基因已被完整敲除掉，经生物荧光检测，突变株不能诱导哈氏弧菌（Vibrio hazy／）BB170的生物发光，说明不能产生信号分子AI-2（autoinducer-2）。DNA测序证实筛选得到了LaxS基因缺失的变形链球菌突变株。连续传代培养后证实，变形链球菌LaxS基因突变株具有良好的稳定性。结论成功构建出LaxS基因缺失的变形链球菌突变株，为研究LaxS基因对变形链球菌致龋毒力的影响奠定了基础。