变形链球菌耐氟株质子移位ATP酶活性的体外研究

目的探讨氟化物对变形链球菌耐氟株质子移位ATP酶活性的影响,并与亲代株进行比较。方法变形链球菌耐氟株和亲代株菌液经反复冻融后,在pH值为5.0、6.0、7.0和8.0的含氟和无氟缓冲液中与ATP反应,测定反应液中无机磷含量及质子移位ATP酶活性,并进行比较。结果在pH值为5.0、6.0、7.0时,变形链球菌耐氟株和亲代株在含氟和无氟缓冲液中的质子移位ATP酶活性均不同,差异有显著性(P<0.05);pH值为5.0、6.0、7.0的含氟缓冲液中,耐氟株的质子移位ATP酶活性大于亲代株的质子移位ATP酶活性(P<0.05);pH为5.0和6.0时,耐氟株在两种缓冲液中的质子移位ATP酶活性之差与亲代株相比差异有显著性(P<0.01)。结论变形链球菌耐氟株的耐酸性比亲代株高,其致龋力大于亲代株。

氟环境下变形链球菌耐氟菌株ciaH、eno和pykF基因的差异表达及其意义

目的:检测变形链球菌耐氟菌株在氟环境下ciaH、eno和pykF基因表达的差异,探讨ciaH、eno和pykF基因与变形链球菌氟抗性的关系。方法:变形链球菌亲代菌株及其耐氟菌株,分为亲代组(变形链球菌亲代菌株生长于无氟BHI培养基中)、耐氟组(耐氟菌株生长于无氟BHI培养基中)和含氟组(耐氟菌株生长于含氟量为1g·L^(-1)的BHI培养基中)。分别选取3组处于生长对数期(11h)和稳定期(20h)的菌株,采用RT-PCR法检测ciaH、eno和pykF mRNA表达水平。结果:与耐氟组比较,含氟组的耐氟菌株ciaH、eno和pykF mRNA表达水平在对数期和稳定期均明显升高(P<0.05或P<0.01);与亲代组比较,耐氟组的耐氟菌株eno和pykF mRNA表达水平在对数期和稳定期均明显降低(P<0.01),ciaH mRNA表达水平在对数期差异无统计学意义(P>0.05),在稳定期明显升高(P<0.01)。结论:氟能提高耐氟菌株ciaH、eno和pykF基因的表达,该组基因与耐氟菌株氟抗性的产生有关联。

变形链球菌耐氟菌株gtfB基因失活菌株的构建

目的:构建变形链球菌(S.mutans)耐氟菌株UA159-FR中gtfB基因失活株,为研究耐氟菌株gtfB基因的功能奠定基础。方法:培养UA159-FR并以其为模板扩增gtfB基因上游、下游同源臂片段,以质粒pEGFP-N1为模板扩增kan基因;通过重叠延伸聚合酶链反应法(overlap extension polymerase chain reaction,OE-PCR)获取上述3个片段的同源重组片段;与pEASY-Blunt Cloning Vector连接形成重组质粒后,进行PCR鉴定和测序鉴定;将重组片段电转化入UA159-FR感受态细胞中得到gtfB基因失活菌株,并进行PCR鉴定。结果:经PCR鉴定和测序鉴定,含有gtfB基因重组片段的重组质粒构建成功;经PCR鉴定,UA159-FR的gtfB基因失活株构建成功。结论:成功构建了含有gtfB基因重组片段的重组质粒和S.mutans耐氟菌株UA159-FR的gtfB基因失活株,可用于gtfB基因功能的研究。

氟化物对变形链球菌耐氟菌株生物膜形成的影响

目的:观察变形链球菌耐氟菌株体外成膜过程,并与亲代菌株进行比较;探讨氟化物对耐氟菌株生物膜形成的影响。方法:变形链球菌耐氟菌株及亲代菌株,分为亲代组(变形链球菌亲代菌株生长于无氟BHI培养基中)、耐氟组(耐氟菌株生长于无氟BHI培养基中)和含氟组(耐氟菌株生长于含氟量为1 g/L的BHI培养基中)。通过结晶紫染色、扫描电镜及激光共聚焦显微镜观察3组在6、12、18、24、36、48 h生物膜形成情况,采用SPSS 21.0单因素方差分析进行统计学比较。结果:(1)结晶紫染色法观察到生物膜生物量随时间增加,24~36 h达到最大值且相对稳定。亲代组及耐氟组生物膜生物量无统计学差异( P >0.05);含氟组生物量在实验的6个时间点均明显少于耐氟组( P <0.05)。(2)扫描电镜可见生物膜随时间的延长结构更加复杂,含氟组在实验时间内未见形成完整生物膜。(3)激光共聚焦实验通过细菌活死染观察到6~24 h生物膜呈绿色荧光,以活菌为主;36~48 h生物膜呈黄色荧光,以死菌为主。在不同时间段,实验组之间细菌密度及活菌比例均存在显著的统计学差异( P <0.01)。结论:通过对变形链球菌耐氟菌株及亲代菌株体外成膜情况无明显差异;氟化物对耐氟菌株生物膜的形成有明显的抑制作用。本实验为后续药物对生物膜防治作用的研究及代谢组学的研究奠定基础。

ffh基因沉默对变形链球菌耐氟菌株耐酸性的影响

目的 ：分析ffh基因沉默对变形链球菌耐氟菌株体外耐酸能力的影响。方法 ：利用电穿孔法,将si RNA转入UA159-FR,使其与ffh基因靶向位点结合,筛选出含ffh基因沉默的变形链球菌耐氟菌株,与UA159-FR的标准菌液分别在不同p H值（以0.5为间隔,p H为3.5~7.5）的BHI液体培养基中37℃微需氧（95%N2、5%CO2）培养24 h,离心,采用p H计测定培养物上清的终末p H值;5 m L生理盐水稀释细菌沉淀,用紫外分光光度计测定600 nm处的吸光度,采用SPSS 17.0软件包对所得数据进行统计学分析。结果：原菌株UA159-FR与ffh基因沉默的变形链球菌UA159-FR相比,Δp H差异显著（P〈0.05）,且前者高于后者。两者比较p H=3.5~5.0时,OD600有显著差异（P〈0.01）;p H=5.5~7.5时,OD600有显著差异（P〈0.05）,且两者生长趋势相似。结论：ffh基因沉默对变形链球菌耐氟菌株的耐酸性有一定影响。

氟环境下变形链球菌耐氟菌株rpl基因的差异表达

目的:检测并分析变形链球菌耐氟菌株在氟环境下培养时rpl基因表达的改变。方法:分别将变形链球菌亲代菌株及耐氟菌株置于无氟脑心浸液(BHI)培养基,另将耐氟菌株置于含1 g/L NaF的BHI培养基中,均培养至11 h(对数生长期)、20 h(稳定生长期)后提取总RNA并逆转录,采用实时定量RT-PCR技术检测各组变形链球菌rpl基因的表达。结果:与无氟培养比较,高氟培养的耐氟菌株rpl基因表达在对数期无差异(P>0.05),而在稳定期表达升高(P<0.001);与亲代菌株比较,耐氟菌株在无氟及高氟培养基中rpl的表达量均明显下降(P<0.001)。结论:氟可以增加稳定生长期的变形链球菌耐氟菌株rpl基因的表达。

变形链球菌耐氟菌株eriC^F基因差异性表达及其意义

目的:探讨不同氟浓度条件下eriC^F1和eriC^F2基因对变形链球菌(S.mutans)耐氟菌株UA159-FR氟抗性的影响,阐明eriCF基因差异性表达与S.mutans耐氟菌株抗性的关系。方法:重组大肠杆菌感受态细胞BL21分为eriC^F1组(eriC^F1+Peasy-Blunt E2)、eriC^F2组(eriC^F2+Peasy-Blunt E2)和KZ组(Peasy-Blunt E2)。基因克隆和IPTG诱导后,检测3组eriC^F1和eriC^F2蛋白表达水平,并分别测定3组菌株在不同氟环境(1.5、2.0、2.5和3.0g·L^-1氟化钠)下的菌液浓度和菌株生长速度,绘制菌株的生长曲线。结果:在对数期(8h)和稳定期(16h),3组菌株在不同氟环境下(1.5、2.0、2.5和3.0g·L^-1氟化钠)的菌液终浓度及菌株生长速度组内比较,3组菌株菌液终浓度和生长速度均随着氟化钠浓度升高而降低;组间比较,相同氟化钠浓度条件下,菌液终浓度和生长速度均为eriC^F2组>eriC^F1组>KZ组(P<0.05或P<0.01);与eriC^F1组比较,eriC^F2组菌液浓度均明显升高(P<0.01)。结论:eriC^F1和eriC^F2基因均能增强大肠杆菌的氟抗性,且表达eriC^F2基因比表达eriC^F1基因的大肠杆菌的氟抗性更强。

耐氟变形链球菌对树脂-牙本质粘接强度的影响

目的:探讨耐氟变形链球菌对树脂牙本质粘接强度的影响。方法:诱导培养耐氟变形链球菌UA159-FR及其亲代菌株UA159,选用复合树脂Z350和自酸蚀粘接剂Single bond Universal,制备牙本质-树脂复合体试件。将试件分为4组,分别浸入UA159-FR菌液、UA159菌液、BHI培养基、PBS中孵育14 d,每48 h换液1次,之后进行推出试验,检测试件粘接强度的变化。扫描电镜下观察4组粘接断面的情况。采用SPSS18.0软件包对数据进行统计学分析。结果:在UA159-FR和UA159侵袭下,牙本质-复合树脂粘接强度显著降低,组间无显著差异。粘接界面多为混合破坏,扫描电镜下可见大量的树脂突及部分粘接面破坏。结论:耐氟变形链球菌可破坏复合树脂粘接界面,引起粘接强度下降,破坏程度在短期内与亲代菌株无显著差异。

耐氟变形链球菌对计算机辅助设计与制造陶瓷与牙体组织粘接的影响

目的:探讨变形链球菌及其耐氟菌株对3种陶瓷与牙釉质、牙本质、流体树脂粘接界面的影响。方法:诱导变形链球菌耐氟菌株,制备瓷-牙釉质/牙本质/流体树脂试件,分别浸于变形链球菌菌液UA159、其耐氟菌株菌液、BHI培养液中,连续培养14d,体视显微镜及电镜下观察粘接界面。结果:(1)瓷-粘接剂界面:浸于UA159的试件瓷与粘接剂间的裂隙要多于浸于耐氟菌株的试件;树脂基陶瓷LavaUltimate与粘接剂之间产生的裂隙最多;(2)粘接剂-牙体组织界面:流体树脂、牙釉质、牙本质与粘接剂间的裂隙依次递增;UA159与其耐氟菌株对此界面产生的破坏比较差异无统计学意义。结论:变形链球菌及其耐氟菌株会对瓷-粘接剂-牙体组织界面产生破坏,且对树脂基陶瓷产生的破坏最大。

变形链球菌及其耐氟菌株对玻璃陶瓷-流体树脂粘接强度的影响研究

目的探讨变形链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)UA159及其耐氟菌株UA159-FR对玻璃陶瓷与流体树脂粘接强度的影响。方法制备玻璃陶瓷-流体树脂试件,分别浸于S.mutans UA159菌液(UA159组)、S.mutans UA159-FR菌液(UA159-FR组)和BHI培养液(对照组)中,连续培养14 d,扫描电镜下观察3组试件的粘接界面情况,并进行微拉伸试验。结果与对照组试件相比,UA159组和UA159-FR组试件树脂粘接剂与瓷块之间有明显裂隙,但树脂粘接剂和流体树脂之间结合紧密;UA159组和UA159-FR组试件的拉伸强度无明显区别,但都低于对照组试件。结论 S.mutans UA159及其耐氟菌株UA159-FR会对玻璃陶瓷-树脂粘接剂-流体树脂界面产生破坏,使玻璃陶瓷与树脂的粘接强度降低。