变性梯度凝胶电泳(DGGE)在微生物生态学中的应用

由于从环境样品中分离和培养细菌的困难 ,分子生物学方法已发展用来描述和鉴定微生物群落。近年来基于 DNA方法的群落分析得到了迅速的发展 ,如 PCR扩增技术 ,克隆文库法 ,荧光原位杂交法 ,限制性酶切片段长度多态性法 ,变性和温度梯度凝胶电泳法。DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌 ,古菌、微微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。这一技术能够提供群落中优势种类信息和同时分析多个样品。具有可重复和容易操作等特点 ,适合于调查种群的时空变化 ,并且可通过对切下的带进行序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落成员。DGGE分析微生物群落的一般步骤如下 :一是核酸的提取 ,二是 1 6Sr RNA,1 8S r RNA或功能基因如可容性甲烷加单氧酶羟化酶基因 ( mmo X)和氨加单氧酶 α-亚单位基因 ( amo A)片段的扩增 ,三是通过DGGE分析 PCR产物。DGGE使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶 ,该凝胶能够有区别的解链PCR扩增产物。由 PCR产生的不同的 DNA片段长度相同但核苷酸序列不同。因此不同的双链 DNA片段由于沿着化学梯度的不同解链行为将在凝胶的不同位置上停止迁移 [5] 。 DNA解链行为的不同导致一个凝胶带图案 ,该图案是微生物群落中主要种类的一个轮廓。 DGGE使用所有生物中保守的基因?

专一性PCR和变性梯度胶电泳协助从焦化废水处理装置中分离优势功能菌Thauera属菌株

【目的】在专一性PCR和变性梯度胶电泳(DGGE)的协助下,从废水处理装置的微生物群落中分离较难分离的功能菌Thauera。【方法和结果】本研究首先使用Thauera特异性PCR-DGGE的方法鉴定了焦化废水处理装置反硝化池生物膜中的Thauera在6种培养基、好氧/厌氧条件下的生长情况。挑选Thauera多样性较高的培养基1/10 NB与MMQ在好氧条件下进行分离培养。然后使用Thauera特异性PCR方法确定分离得到的菌落是否呈阳性,并使用DGGE的方法检验其是否为纯菌。使用不同培养基对含有Thauera的混合菌落进行进一步纯化,DGGE检测发现MMP培养基对混合细菌菌落Q20中的Thauera有明显的富集作用。经过Thauera特异性PCR结合DGGE检测对Thauera属细菌进行追踪,将混合菌落在MMP培养基上多次划线,最终分离得到纯菌。通过这种方法,从反硝化池样品中分离获得了3株在样品中最为主要的Thauera菌株。【结论】以特异性分子标记为导向分离培养细菌,不仅提高了分离效率及细菌筛选的灵敏度,还能协助分离常规方法难以分离的细菌。

变性梯度凝胶电泳技术在微生物多样性研究中的应用

变性梯度凝胶电泳是不依赖于培养的、依据DNA分子的大小和所带电荷分析微生物多样性和动态变化的分子生物学技术,具有检测极限低、分析速度快及重复性好等优点。主要对变性梯度凝胶电泳原理、特点及其在微生物多样性应用方面进行综述。

利用变性梯度凝胶电泳分析微生物的多样性

综述了不依赖于培养的变性梯度凝胶电泳技术 (DGGE)分析微生物多样性的原理 ,并列举它的应用实例。DGGE和传统方法相比有很多优点 ,若将DGGE和其他方法结合起来 ,效果更好 ,应用更广泛。

变性梯度凝胶电泳技术及其在食品微生物研究中的应用

食品中的很多微生物无法分离培养,传统的微生物研究方法不仅费时费力,而且会造成偏差。变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)是一种不依赖于纯培养的分子技术,因其快速、灵敏、分析全面等特点已被广泛应用于微生物生态学的研究中。本文介绍了DGGE的发展历程、原理、操作步骤及其在食品微生物研究中的进展,评价了该技术的优势和局限性,展望了其在食品领域内的应用前景。

常见赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳分析

为了解我国典型有毒有害赤潮藻类的变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱以及DGGE技术在赤潮藻类分析鉴定中的作用,本课题组运用DGGE技术,研究了我国沿海7种重要赤潮藻类的单一种类以及混合种类样品的18S rDNA V3区的DGGE指纹图谱,并且对2009年10月底在广东省珠海海域发生的双胞旋沟藻(Cochlodini-um geminatum)赤潮样品进行了DGGE分析.结果表明,DGGE技术能够对环节环沟藻、海洋原甲藻、血红哈卡藻、锥状斯氏藻、中肋骨条藻、塔玛亚历山大藻、双胞旋沟藻7种常见的海洋赤潮藻类具有较好的区分效果,同时监测出赤潮样品中双胞旋沟藻、血红哈卡藻、环节环沟藻和海洋原甲藻4种优势种,种类组成与显微镜观察结果具有较好的一致性.结果说明DGGE技术可作为一种辅助方法对赤潮藻类进行分类鉴定.

变性梯度凝胶电泳的原理、应用及其进展

变性梯度凝胶电泳 (DGGE)主要是基于突变型和野生型核酸序列的不同而导致其变性浓度的差异 ,利用变性梯度胶进行分离。恒定变性凝胶电泳 (CDGE)、瞬时温度梯度电泳 (TTGE)和温度梯度凝胶电泳 (TGGE)是由 DGGE经改进而成。

变性梯度凝胶电泳技术的原理及其在畜牧业中的应用

变性梯度凝胶电泳（DenaturingGradientGelE1ectrophoresiS，DGGE）是由Fisher和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，1993年Muyzer等首次将其用于分析土壤的微生物区系，成为检测微生物多样性，的一种有效方法。近年来开始运用于动物胃肠道微生物的研究，通过DGGE研究微生物数量及多样性，了解肠道微生物的结构和组成。本文就DGGE技术的原理、优缺点及其在畜牧业中的应用作一综述。

用于分析土壤微生物结构变化规律的变性梯度凝胶电泳条件研究

研究确定土壤微生物基因组DNA提取方法、PCR扩增条件、DGGE电泳条件,为进一步研究分析土壤中微生物结构变化规律提供理论依据。土壤微生物基因组DNA提取采用直接法和间接法进行比较; PCR扩增条件调整扩增体系、DGGE电泳条件调整变性剂范围,并对其结果进行比较分析。通过对DGGE电泳相关条件的研究,结果显示,土壤中粗基因组DNA采用直接法提取,然后进行纯化; PCR扩增体系中加入BSA,DGGE电泳系统组成中变性剂浓度范围为35%～55%。确定了土壤微生物基因组DNA提取方法、PCR扩增条件、DGGE电泳条件,为后续的相关研究提供理论依据。

垂直变性梯度凝胶电泳在大肠癌APEX基因变异检测中的应用

目的探讨变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)在大肠癌APEX基因单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)或基因突变筛选中的应用价值。方法对散发性大肠癌APEX基因5个外显子进行DGGE检测及DNA测序,分析DGGE带型和测序结果之间的关系。结果根据DGGE原理及实验观察结果,发现无论何种碱基改变,在DGGE胶上通常只可能呈现4种带型中的一种,本研究发现其中的3种。杂合子的特征是在变性胶的泳道上出现不同水平的4条带,纯合子呈单一条带;带有错配的DNA分子在凝胶上的位置总是落后于没有错配的分子;当碱基改变为A/T→G/C时,突变DNA分子泳动较快,其条带位于野生型分子之前,当碱基改变为G/C→A/T时,结果相反。结论对于一已知的SNP,利用DGGE带型可以判断SNP的基因型和等位基因频率而免去进一步测序工作;对突变检测而言,DGGE可预测碱基改变的类型,有利于对测序结果判读的准确性。

变性梯度凝胶电泳检测轻型血友病甲的基因突变(Arg1689Cys)

血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病,由因子FⅧ缺乏引起。应用聚合酶链反应和变性梯度凝胶电泳技术,在一例轻型血友病甲患者的因子Ⅷ基因第14号外显子3’端发现碱基替换;直接测序表明密码子CGC突变为TGC,导致FⅧ蛋白Arg1689Cys,使凝血活化FⅧ发生障碍。该突变同时产生一个PstⅠ限制性酶切位点,该突变已证实与血友病相关。

应用变性梯度凝胶电泳研究厦门西海域超微型真核浮游生物多样性

应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法对厦门西海域超微型真核浮游生物的遗传多样性进行周年变化特征研究分析。结果表明,厦门西海域典型测站的超微型真核浮游生物群落具有丰富的多样性组成;厦门西海域超微型真核浮游生物群落遗传结构和主要类群组成季节性变化显著:不同典型测站之间的超微型真核浮游生物群落遗传结构的周年变化特征相似;不同典型测站之间的超微型真核浮游生物群落的类群组成也很相似,由绿藻、Stramenopiles、定鞭金藻、甲藻、未确定类群(unidentified groups)和其他类群组成。

应用变性梯度凝胶电泳和16S rDNA序列分析对kefir粒中细菌多样性的研究

以开菲尔(Kefir)粒为材料,经过DNA抽提和16S rDNA V3区PCR扩增,扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离并切割电泳条带进行序列测定,并与现有的数据库进行了比较,对Kefir粒的细菌多样性进行分析。结果表明,DGGE图谱中可检测到的8条带的16S rDNA基因序列中有7个基因序列与GenBank数据库登录的相关序列的相似性大于98%,余下的1个基因序列的相似性也大于96%。相似性大于98%的7个克隆中,有3个属于鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium),2个属于乳杆菌属(Lactobacillus),其它2个分别属于肠杆菌属(Enterobacter)和不动杆菌属(Acinetobacter)。首次报道了鞘氨醇杆菌作为优势菌群存在开菲尔Kefir粒中。

排除法PCR加变性梯度凝胶电泳鉴别未知基因

通过鉴别未知的cry4亚组基因来确定排除法PCR加变性梯度凝胶电泳新方法。方法 :应用排除法PCR的组基因和亚组基因引物扩增杀蚊毒素基因 ,cry4。这些引物是根据已知的cyr4基因的共有或特有DNA片段来设计的。组基因引物扩增产物被用于变性梯度凝胶电泳。平行变性梯度凝胶是由 8%的聚丙烯酰胺加上 2 0 %到 80 %的变性剂组成。结果 :已知的和未知的cry4亚组基因被组基因引物扩增的产物在变性梯度凝胶电泳被分离开。尽管它们之间仅有两个碱基对不同 (T在位置 2 2 4和G在位置 394)。应用组基因和亚组基因引物扩增 ,新发现的基因可被分类到次亚组基因水平。从 5个苏云金芽孢杆菌亚菌中发现三个未发表的cry4亚组基因。结论 :排除法PCR加变性梯度凝胶电泳是一个高度敏感、特异性和可靠性强的新方法 ,可用于鉴别各种未知的亚组基因。

PCR-DGGE技术用于湖泊沉积物中微生物群落结构多样性研究

采用PCR-DGGE分子指纹图谱技术比较南京市玄武湖、奠愁湖和太湖不同位置的表层沉积物微生物群落结构，研究结果表明，三湖泊沉积物微生物的16SrDNA的PCR扩增结果约为626bp，为16S rDNA V3～V5区特异性片段。玄武湖和莫愁湖表层沉积物中大约有20种优势菌群，且同一湖泊不同采样点DGGE图谱的差异性不大，细菌群落结构具有较高的相似性，而太湖样品DGGE条带的数目和位置表现出明显差异，且不同采样点图谱的差异性较大。三湖泊除具有特征性的微生物种属外，还分布约5个相同的细菌种群，可能与沉积物的理化性质和水生植被的影响相关。对DGGE图谱中7条主带进行回收、扩增和测序，结果显示其优势菌群具有不同的序列组成，其中5个序列与Genebank中已登录的细菌种群的同源性≥99％，2个序列的同源性为96％和93％，其中2个相似的细菌类群目前尚未获得纯培养。

应用PCR-DGGE技术解析白酒大曲细菌群落结构

应用DGGE技术分析不同批次的大曲细菌群落结构,采用SDS+酶法提取大曲基因组DNA,以细菌通用引物进行16SrRNA基因V3高变异区PCR扩增,将产物进行DGGE分离,获得表征大曲细菌群落结构的DGGE指纹图谱,结果表明,不同批次的大曲细菌群落结构组成类似,系统发育分析结果显示大曲中细菌主要属于厚壁菌门(Firmicutes),包括乳杆菌科(Lactobacillaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)和放线菌科(Thermoactino-mycetaceae)等。另外在大曲中除了存在酒醅中多有发现的细菌外,还存在着不可培养的微生物。

PCR-DGGE技术在农田土壤微生物多样性研究中的应用

变性梯度凝胶电泳技术 ( DGGE)在微生物生态学领域有着广泛的应用。研究采用化学裂解法直接提取出不同农田土壤微生物基因组 DNA,并以此基因组 DNA为模板 ,选择特异性引物 F357GC和 R518对 1 6Sr RNA基因的 V3区进行扩增 ,长约 2 30 bp的 PCR产物经变性梯度凝胶电泳 ( DGGE)进行分离后 ,得到不同数目且分离效果较好的电泳条带。结果说明 ,DGGE能够对土壤样品中的不同微生物的 1 6Sr RNA基因的 V3区的 DNA扩增片断进行分离 ,为这些 DNA片断的定性和鉴定提供了条件。与传统的平板培养方法相比 ,变性梯度凝胶电泳 ( DGGE)技术能够更精确的反映出土壤微生物多样性 ,它是一种有效的微生物多样性研究技术。

DG-DGGE分析产氢发酵系统微生物群落动态及种群多样性

应用双梯度-变性梯度凝胶电泳(DG-DGGE)对生物制氢反应器微生物种群的动态变化及多样性进行监测。间隔7d从反应器取厌氧活性污泥,以细菌16SrDNA通用引物进行V2～V3区域PCR扩增,长约450bp的PCR产物经DGGE分离后,获得污泥微生物群落的16SrDNA指纹图谱。污泥接种到反应器后微生物群落中既有原始种群的消亡和增长,也有次级种群的强化和演变。反应器在运行初期群落演替迅速,15d时微生物群落结构变化最大。群落结构的相似性随着演替时间的增加而逐渐升高,种群动态变化后形成稳定的群落结构。29d时微生物多样性基本保持不变,微生物优势种属达到19个OTU。在细菌竞争和协同作用制约下,种群多样性降低后趋于稳定,形成顶级群落。有些种群在群落结构中一直存在,是群落建成的原始种群,原始种群与次级种群在代谢过程中具有协同作用,表现出群落的综合生态特征。

利用PCR-DGGE技术指导高温油藏中功能微生物的分离

采用PCR-DGGE技术对高温油藏的微生物群落进行了多样性分析,并将得到的信息用于指导油藏微生物的分离.本研究通过PCR-DGGE技术对油藏水样中DNA的16S rDNA V3、V8、V9 3个高可变区的扩增产物进行了比较,确定采用可得到更多微生物多样性信息的V9区引物进行PCR扩增,优势条带序列分析表明,在高温油藏中存在的微生物与GenBank数据库中α,β,γ-变形杆菌和芽孢杆菌的序列相似性最高.利用多元细菌培养技术,以序列信息为指导,采用富集培养、直接培养和特殊培养的方法,从水样中分离出5株高温菌(而传统分离方法只能获得3株),其中3株高温解烃菌分别属于Bacillus属、Geobacillus属和Petrobacter属,它们能够在55℃以上兼性厌氧条件良好生长,对原油的降解率分别为56.5%7、0.01%和31.87%,对原油的降粘率分别为40%、54.55%和29.09%,使原油的凝固点分别降低3.7、5.2和3.1℃.因此,序列指导和改变培养条件是分离更多有效采油微生物的改进方法,这3株高温菌的对原油的作用效果证明其具备提高石油采收率的潜力.

PCR-DGGE方法分析原油储层微生物群落结构及种群多样性

使用基于 16 S r DNA的 PCR- DGGE(变性梯度凝胶电泳 )图谱分析结合条带割胶回收 DNA进行序列分析 ,对新疆克拉玛依油田一中区注水井 (12 # 9- 11)和与该注水井相应的两个采油井 (12 # 9- 9S、13# 11- 8)井口样品微生物群落的多样性进行了比较并鉴定了部分群落成员。 DGGE图谱聚类分析表明注水井与两油井微生物群落的相似性分别为 30 %和 2 0 % ,而两油井间微生物群落结构的相似性为 5 4 %。DGGE图谱中优势条带序列分析表明注水井样品和油井样品中的优势菌群为未培养的环境微生物 ,它们与数据库中 α、γ、δ、ε变形杆菌 (Proteobacteria)和拟杆菌 (Bacteroidetes)有很近的亲缘关系。 DGGE与分子克隆相结合的分子生物学方法在研究微生物提高原油采收率 (MEOR)机理 ,以及指导