重组杂合蛛丝蛋白MiSpNT-PySpRp-MiSpCT的二级结构表征

重组蛛丝纤维作为一种性能优异的生物材料,具有良好的生物相容性,在生物医学工程领域具有极大的潜在应用价值。已有研究表明,重组蛛丝蛋白可用作血管、神经导管及药物载体等,但其生物学功能仍有待研究。本研究以大腹园蛛基因组为模板,设计特异性引物,通过PCR扩增获得大腹园蛛梨状腺丝(piriform spidroin:Py Sp)一个完整重复区(Rp)编码序列;此Rp模块与Mi Sp NT/CT模块重组,构建微小型杂合蛛丝蛋白Mi Sp NT-Py SpRp-Mi Sp CT,成功在大肠杆菌BL21中高效表达,借助8 mol/L尿素裂解缓冲液进行变性纯化,得到纯度较高的杂合蛛丝蛋白Mi Sp NTPy SpRp-Mi Sp CT,产量约100 mg/L。CD图谱显示,Mi Sp NT-Py SpRp-Mi Sp CT蛋白质溶液主要以α-螺旋和无规卷曲形式存在,随着溶液p H值降低,部分α-螺旋向β-折叠转变;红外光谱显示,在自然成丝及冻干过程中,部分α-螺旋转化为β-折叠,符合天然蛛丝蛋白成丝过程的二级结构变化特征。本研究结果为今后获得具有天然蛛丝纤维优异性能的人工重组蛛丝纤维材料提供一种新的可能。

变性-复性法构建自组装蛋白质纳米粒

采用富阳离子多肽诱导重组蛋白自组装为纳米粒策略有望保持蛋白药物的活性、生物相容性,同时延长其半衰期、提高靶向性,有广泛的应用前景。维持蛋白质药物(尤其是具有多个半胱氨酸残基的蛋白质)在自组装纳米粒中的活性结构对于该类药物的研究至关重要。该研究设计了具有多个游离半胱氨酸残基的重组蛋白CRGDC-T22-TAT-Beclin1-GFP-RGDKG-His tag及其对照蛋白序列,构建表达载体、获得大肠杆菌Trans B(DE3)工程菌。该研究分析了非变性条件和变性条件下进行Ni-NTA亲和层析纯化的差异。在变性条件下纯化获得重组蛋白,经复性后得到自组装蛋白质纳米粒,采用动态光散射法测定蛋白纳米粒粒径,使用酶标仪分析重组蛋白的荧光特性,用CCK-8法测定蛋白质纳米粒抑制MCF-7细胞生长的活性。结果显示,重组蛋白CRGDC-T22-TATBeclin1-GFP-RGDKG-His tag形成的纳米粒粒径为(45.13±5.78)nm;其荧光最大发射波长为510 nm,与野生型GFP相同;浓度为10μmol/L的重组蛋白与人乳腺癌细胞MCF-7共同孵育48 h,可将细胞活力降低至31.00%±1.13%。以上结果表明,相比于非变性纯化法,采用变性-复性法可以纯化具有多个半胱氨酸残基的重组蛋白,获得具活性的自组装蛋白质纳米粒。