变性高压液相色谱技术在检测结核分枝杆菌对链霉素耐药性中的应用

目的利用变性高压液相色谱（DHPLC）技术快速检测结核分枝杆菌rpsL基因的突变，从而对结核分枝杆菌是否耐受链霉素类药物做出初步判断。方法体外药物敏感性试验，确定122株结核分枝杆菌临床分离株对链霉素的敏感程度。提取试验菌株基因组DNA。扩增rpsL基因片段；分别与H37Rv标准株的相应PCR产物混合、杂交后，利用WAVE核苷酸片段分析系统对各杂交产物进行DHPLC检测；序列测定结果与相应的DHPLC检测结果进行比较以验证DHPLC检测的准确性。通过比较药物敏感性和DHPLC检测结果。建立两者之间的对应关系。此外我们还检测了32株对链酶素敏感的临床分离株进行了DHPLC法检测。以明确该检测方法的特异性。结果结核分枝杆菌临床分离株对链霉素耐药性经体外实验证明，rpsL基因43位氨基酸突变通常会引起较高程度的链霉素耐药性。88位氨基酸突变菌株对链霉素的耐药性较低。链霉素耐药菌中发生rpsL基因突变的菌株约占78．69％（96／122）。其中以43位氨基酸突变为主（75．41％）。利用DHPLC技术检测rpsL基因突变，虽然不能检出缺失突变形式，但与直接测序法相比检出率为98．95％（95／96）。对所有耐受链霉素的结核分枝杆菌临床分离株而言。利用DHPLC技术可以达到77．87％（95／122）的耐药菌检出率，与序列测定法的检出率相近（96／122）。并且根据DHPLC检测图谱能够很好地判断rpsL基因的碱基突变形式。32株链酶素株的DHPLC检测图谱都与H37Rv标准株相同。结论DHPLC法是快速检测出结核分枝杆菌rpsL基因碱基突变的好方法．具有很高的特异性和敏感性。对链霉素耐药菌而言，碱基突变与结核分枝杆菌耐受链霉素类抗生素存在高度的相关关系，因此DHPLC技术用于临床早期检测结核病人对链霉素的耐药性具有良好的应用前景。

中国人群中C6orf37第二外显子VNTR多态性的研究

目的:证实C 6orf 37编码区VNTR位点,检测其多态性在中国人群中的分布特点,并寻找VNTR多态性检测的理想方法。方法:用RT-PCR及测序证实C 6orf 37编码区的VNTR位点,并用SSLP和DHPLC两种方法对166例中国人进行VNTR基因分型。结果:C 6orf 37基因的第二外显子区存在一个新的VNTR多态性位点,其核心序列为GGCGGCGACTTCGGC,编码5个氨基酸(G-G-D-F-G),重复3到5次。该位点存在3种等位基因:a(3次重复),b(4次重复),c(5次重复),6种基因型:a/a,b/b,c/c,a/b,a/c,b/c。在中国人群中的a、b、c等位基因频率分别为0.145,0.304,0.551。杂和度为0.583,多态信息含量为0.510。DHPLC与SSLP检测VNTR多态性的结果一致,但DHPLC具有快速、经济、高通量的特点。结论:C 6orf 37编码区存在一个高度多态性VNTR位点,DHPLC是大规模筛选VNTR多态性的理想方法。