变性高压液相色谱技术在检测结核分枝杆菌对链霉素耐药性中的应用

目的利用变性高压液相色谱（DHPLC）技术快速检测结核分枝杆菌rpsL基因的突变，从而对结核分枝杆菌是否耐受链霉素类药物做出初步判断。方法体外药物敏感性试验，确定122株结核分枝杆菌临床分离株对链霉素的敏感程度。提取试验菌株基因组DNA。扩增rpsL基因片段；分别与H37Rv标准株的相应PCR产物混合、杂交后，利用WAVE核苷酸片段分析系统对各杂交产物进行DHPLC检测；序列测定结果与相应的DHPLC检测结果进行比较以验证DHPLC检测的准确性。通过比较药物敏感性和DHPLC检测结果。建立两者之间的对应关系。此外我们还检测了32株对链酶素敏感的临床分离株进行了DHPLC法检测。以明确该检测方法的特异性。结果结核分枝杆菌临床分离株对链霉素耐药性经体外实验证明，rpsL基因43位氨基酸突变通常会引起较高程度的链霉素耐药性。88位氨基酸突变菌株对链霉素的耐药性较低。链霉素耐药菌中发生rpsL基因突变的菌株约占78．69％（96／122）。其中以43位氨基酸突变为主（75．41％）。利用DHPLC技术检测rpsL基因突变，虽然不能检出缺失突变形式，但与直接测序法相比检出率为98．95％（95／96）。对所有耐受链霉素的结核分枝杆菌临床分离株而言。利用DHPLC技术可以达到77．87％（95／122）的耐药菌检出率，与序列测定法的检出率相近（96／122）。并且根据DHPLC检测图谱能够很好地判断rpsL基因的碱基突变形式。32株链酶素株的DHPLC检测图谱都与H37Rv标准株相同。结论DHPLC法是快速检测出结核分枝杆菌rpsL基因碱基突变的好方法．具有很高的特异性和敏感性。对链霉素耐药菌而言，碱基突变与结核分枝杆菌耐受链霉素类抗生素存在高度的相关关系，因此DHPLC技术用于临床早期检测结核病人对链霉素的耐药性具有良好的应用前景。

利用变性高效液相色谱(dHPLC)进行小麦等位基因差异表达分析

等位基因变异是生物体基因组中普遍存在的现象,也是物种进化和育种的重要基础.等位基因可以通过编码区的改变或者表达来影响基因的功能,因此研究等位基因的表达具有重要的生物学意义.由于小麦基因组的复杂性,造成等位基因的鉴定比较困难,这极大地制约了小麦等位基因表达研究的开展.利用CAU36和CAU328两个EST-SSR标记,结合变性高效液相色谱(dHPLC)分析技术,在35个小麦基因型中分别检测到4种和3种等位变异类型,并且以抽穗期的穗下节节间为材料,对其在4×6的小麦双列杂交组合杂交F1代中进行了表达分析.结果表明,这两个EST-SSR引物扩增的等位基因在多个组合中均存在显著的差异表达,且CAU36标记检测到的等位基因表达变化值与部分杂交种的株高之间存在显著的相关性.

筛查未知SNPs的变性高效液相色谱(DHPLC)技术

本文介绍了 DHPL C技术的基本原理 ,主要应用领域 ,实验技术特点和操作的注意事项。指出 DHPL C是快速、准确、高效筛查基因未知 SNPs的工具 ,优于测序等分子生物学方法 ,在功能基因组学。

高效液相色谱法测定非变性Ⅱ型胶原蛋白含量的研究

研究非变性Ⅱ型胶原蛋白含量的测定方法,对样品中的目标成分进行测定和方法学验证分析。通过高效液相色谱法(HPLC)测定非变性Ⅱ型胶原蛋白的含量,考察线性、精密度、准确度、耐用性。实验结果表明,非变性Ⅱ型胶原蛋白(以L-羟脯氨酸计),在0~398.48μg/mL范围内线性关系较好;精密度较好;平均回收率为99.2%,RSD为0.87%;耐用性较好。经过全面的方法学验证,该实验方法稳定可靠,适用于高效液相色谱法测定非变性Ⅱ型胶原蛋白的含量,并可应用于相关产品的质量控制工作。

运用变性高效液相色谱(DHPLC)对中国人非综合征性耳聋进行GJB2基因突变分析

目的分析中国人非综合征性耳聋GJB2基因的突变频率和特性,并探讨其基因型与表型的关系。方法聚合酶链反应扩增目的片段,变性高效液相色谱进行突变筛查,阳性结果直接测序,对GJB2杂合突变病人进行△(GJB6-D13S1830)突变检测。结果DHPLC突变检测的敏感性和特异性均达到了100%。在255个非综合征性耳聋家系先证者中,共检测到14种GJB2变异,其中235delC是最常见的突变类型,占所有突变的75%。在115例正常人中79G>A和341A>G两种多态的等位基因频率分别为24.8%和20.9%。在12例GJB2杂合突变病人中未检测到△(GJB6-D13S1830)突变。结论GJB2突变是导致学语前聋的主要原因,28.6%的学语前隐性和18.9%学语前散发非综合征性耳聋病人携带了两个GJB2突变。在中国人群中,235delC是GJB2基因最常见的突变形式,而79G>A和341A>G是GJB2基因最常见的两种多态。

DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响

背景与目的:变性高效液相色谱(denaturinghigh-performanceliquidchromatography,DHPLC)是最近发展起来的一种灵敏而高通量的基因突变检测技术,在工作中我们发现某些因素,尤其是DNA聚合酶干扰DHPLC分辨力。本文详细地分析了具校正功能和非校正功能的DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响,旨在寻找更适合DHPLC分析的DNA聚合酶。方法:选择长度为268bp、317bp、590bp的3个代表性的片段用于DHPLC分析。选择6种品牌的TaqDNA聚合酶,1种Ampli-TaqgoldDNA聚合酶,4种具校正功能的DNA聚合酶(Pfu和Vent),用这11种酶扩增同一DNA片段,并进行DHPLC检测,分析并鉴定它们对DHPLC峰型的影响。结果:TaqDNA聚合酶对DHPLC分析产生两种明显的负面影响。一是在DHPLC图谱的主峰前,形成一个额外小峰,影响DHPLC对杂合双链的分辨能力。另一种影响是难以形成正常的DHPLC色谱图,导致DHPLC检测的失败。具校正功能的DNA聚合酶和TaqgoldDNA聚合酶对DHPLC几乎不产生这些负面影响。结论:具校正功能的DNA聚合酶比Taq聚合酶更适合于DHPLC突变或SNP分析,尤其是GC含量高的小片段或其它容易受干扰的片段应首选PfuDNA聚合酶用于DHPLC分析。

变性高效液相色谱检测食品中致泻性大肠杆菌

【目的】应用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中致泻性大肠杆菌的快速检测方法。【方法】分别根据4种致泻性大肠杆菌的特异性毒力因子基因序列设计引物,PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。以肠产毒性大肠杆菌等32株试验菌株做特异性检测;4种致泻性大肠杆菌标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。【结果】试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:肠产毒性大肠杆菌27CFU/mL、肠致病性大肠杆菌33CFU/mL、肠出血性大肠杆菌25CFU/mL、肠侵袭性大肠杆菌42CFU/mL。【结论】该方法可以快速、准确地检测食品中的致泻性大肠杆菌,是食品中病原菌检测的新技术和新方法。

变性高效液相色谱（DHPLC）技术在神经变性病的应用研究

阿尔茨海默病（AD）是第一大神经变性病，它是以脑组织切片上包含体存在为特征。临床流行病学统计结果表明AD存在高发病率，高致残率，低就诊率。并且随着我国人口越来越老龄化，AD患者更有进一步增加的趋势。研究表明致病基因的各种各样的变异与AD密切相关，但都停留在实验室的阶段，无法规模化对大量的疾病相关位点进行基因突变筛查即作为常规的辅助诊断应用于临床。

核桃仁种皮中的多酚类物质高压液相色谱分析

采用HPLC对核桃仁种皮中的多酚类物质进行了分析研究。结果表明:核桃仁种皮中的酚酸类物质检测到17种,标样中的6种全部含有,含量最高的是没食子酸,为146.2mg/100g干样,含量最少的是阿魏酸,为6.1mg/100g干样;黄酮类物质检测到8种,标样中芦丁的含量最高,为187.6mg/100g干样,桑色素没有检测到。

固相萃取-超高压液相色谱-串联质谱同时分析环境水样中四环素类和喹诺酮类抗生素

应用固相萃取及超高压液相色谱-质谱联用技术，建立了环境水样中4种四环素类和6种喹诺酮类抗生素的同时分析方法。样品经HLB固相萃取柱富集、净化后用甲醇洗脱，以超高压液相色谱-串联质谱仪多反应监测（MRM）离子模式定性、定量分析。以河水和海水为基质，卡巴氧为替代物进行回收率评价，4种四环素类抗生素在加标质量浓度分别为20．0ng／L和100．0ng／L时的回收率为94．0％～117．0％，相对标准偏差为2．0％～9．7％（n=4），方法的检出限均为20．0ng／L；6种喹诺酮类抗生素在加标质量浓度分别为5．0ng／L和20．0ng／L时的回收率为53．6％～93．9％，相对标准偏差为1．6％～8．1％（n=4），方法的检出限为0．4ng／L。结果表明，所建立的方法可成功地应用于近岸海域表层环境水样中目标抗生素残留的分析。

超高压液相色谱荧光检测法快速测定水中痕量苯胺与联苯胺

建立了直接进样/超高压液相色谱荧光检测法快速分析水中苯胺和联苯胺的新方法。通过研究流动相、水样pH值、水样电导率和滤器材质的影响,确定了最优化的实验方案。水样直接通过0.22μm微孔滤膜(聚四氟乙烯材质)过滤,以乙腈-3.85 g/L醋酸铵(25∶75)为流动相,荧光检测器(苯胺λex/λem=232nm/329 nm,联苯胺λex/λem=292 nm/383 nm)在0.8 min内完成分析。苯胺和联苯胺在1.0～100.0μg/L范围内线性关系良好,相关系数均大于0.999,仪器精密度(n=10)分别为0.4%和0.5%,方法检出限(S/N=3)分别为0.023μg/L和0.024μg/L,方法定量下限(S/N=10)为0.078μg/L和0.079μg/L,方法回收率为86%～106%。该方法具有前处理简单、方法检出限低、分析速度快等优点,适用于水体中苯胺和联苯胺的快速检测。

高压液相色谱法分析常见单糖、双糖

本文介绍用高压液相色谱法分析常见的单糖、双糖。选用氨基色谱柱及离子交换色谱柱，用示差折光检测器进行检测，使单糖得到较好的分离，测定方法快速、简便。

高压液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱(HPLC-HG-AFS)联用技术检测水产品中硒的赋存形态

目的采用高压液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱联用技术(HPLC-HG-AFS)对水产品中硒的赋存形态检测进行研究。方法通过实验优化流动相、提取剂、提取时间及其仪器条件,建立HPLC-HG-AFS联用技术检测水产品中硒形态的分析方法。用去离子水在70℃水浴下超声提取1 h,流动相为pH 6.0的40mmol/L(NH4)2HPO4溶液,阴离子交换柱分离,HG-AFS检测。结果样品加标量在0.10、1.00 mg/kg时的回收率均在86.6%以上,相对标准偏差均小于5%。结论本研究证明使用该方法测定水产品中的硒形态较为准确、可靠,为科学评价水产品质量、进一步细化富硒水产品的判定标准和鉴别其真伪提供技术手段,为科学有效地开展其风险评估提供技术支撑和数据支持。

稳定同位素内标/超高压液相色谱-串联质谱法同时测定水果与豆芽中10种植物生长调节剂残留

建立了水果与豆芽中10种植物生长调节剂残留的超高压液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)分析方法。以酸化乙腈(1∶1 000,体积比)为提取液,样品经高速匀浆与超声辅助分散提取后,提取液采用固相萃取柱净化,甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液为流动相,梯度洗脱,电喷雾电离,正负离子扫描,多反应监测模式(MRM)检测,基质匹配同位素内标标准曲线定量。最优条件下,10种植物生长调节剂残留在0.1~50.0μg/L浓度范围内线性关系良好,相关系数(r2)均大于0.995,检出限为0.2μg/kg,平均回收率为52.4%~119.6%,相对标准偏差(RSD)均小于13%。该方法样品前处理简单、净化效果好,同位素内标的使用解决了基质效应及前处理过程中待测物损失造成定量结果不准确的问题,适用于大批量果蔬中多种植物生长调节剂的快速测定。

超高压液相色谱-质谱同时测定白酒中6种微量甜味剂的方法研究

为了检测白酒中6种甜味剂（安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜）,建立了一种超高压液相色谱质谱联用的新方法。样品预处理后,通过BEH C-18色谱柱分离,以甲醇-20 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱,在ESI负离子模式下检测,一次进样分析仅需10 min。以优化后的条件进行测定,6种甜味剂线性范围均在0.05－5.0 mg/L内,线性相关系数均大于0.994 5。得到安赛蜜检出限为0.05 mg/L、糖精钠、甜蜜素、纽甜检出限为0.01 mg/L、三氯蔗糖、阿斯巴甜检出限为0.1 mg/L。加标水平为0.5 mg/L和1.0 mg/L时,回收率在86.48%－116.90%之间,相对标准偏差为0.22%-3.90%。方法准确可靠、简便快速、可达到同时检测6种甜味剂的目的。

饱和烃和芳烃的高压液相色谱法精细分离

该文介绍了用高压液相色谱对族组分中的饱和烃、单环芳烃、二环芳烃及三环以上芳烃的精细分离方法。用二级活度的氧化铝除去非烃和沥青质,用正己烷和二氯甲烷依次淋洗出(硅胶)色谱柱上的饱和烃、单环芳烃、二环芳烃及三环以上芳烃。该方法同国外方法相比具有快速、节省试剂的优点,色质谱图显示各组分有较高的分离度。

固相萃取/超高压液相色谱测定水中痕量呋喃丹、甲萘威及阿特拉津

建立了固相萃取/超高压液相色谱测定水中痕量呋喃丹、甲萘威和阿特拉津的分析方法。通过对色谱流动相和紫外检测条件、固萃小柱和上样速度、滤器材质等进行优化,确定了最佳实验方案。水样以5～10 mL/min的速度上样,采用Bond Elute Plexa固相萃取小柱富集,二氯甲烷洗脱。洗脱液经浓缩和重溶后,过尼龙滤膜,采用超高压液相色谱分析,色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7μm),流动相为甲醇-水(55∶45),检测波长为222 nm,流速为0.4 mL/min。在优化条件下,1.5 min内可对3种化合物实现基线分离。呋喃丹、甲萘威和阿特拉津在0.1～2.0 mg/L范围内的线性系数均大于0.999,其仪器精密度(n=9)分别为1.7%、0.2%和0.7%,方法检出限(S/N=3)分别为0.04、0.003、0.004μg/L。在高、低水平加标浓度下,方法回收率为74%～94%。该方法具有分析速度快、操作简单和检出限低等优点,可用于同时分析水体中痕量的呋喃丹、甲萘威和阿特拉津。

超高压液相色谱-串联质谱法同时测定婴幼儿配方乳粉中11种B族维生素

目的：建立一种能够同时测定婴幼儿配方乳粉中11种B族维生素的超高压液相色谱-串联质谱法。方法：样品用0.1%甲酸溶液溶解,乙酸锌沉淀蛋白,滤液经ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱分离,流动相为0.1%甲酸溶液和乙腈,梯度洗脱,采用电喷雾离子源正离子模式,多反应监测进行检测,分析时间12 min。结果：11种B族维生素在各自质量浓度范围内线性良好,R^2均大于0.99,加标回收率在85%-110%之间,相对标准偏差在1.03%-6.75%之间,VB1、VB2、烟酸、烟酰胺、泛酸（VB5）、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺、叶酸、游离生物素和VB12的定量下限分别为40.0、40.0、30.0、30.0、50.0、0.9、1.2、1.2、2.0、2.0、0.2μg/100 g,与国家标准比较,部分维生素定量限提高了7.7%-60%。结论：该法具有灵敏度高、前处理操作简单快速、分析时间短的特点,而且具有良好的精密度和准确性,可以应用于婴幼儿配方乳粉中11种B族维生素的同时测定。