DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响

背景与目的:变性高效液相色谱(denaturinghigh-performanceliquidchromatography,DHPLC)是最近发展起来的一种灵敏而高通量的基因突变检测技术,在工作中我们发现某些因素,尤其是DNA聚合酶干扰DHPLC分辨力。本文详细地分析了具校正功能和非校正功能的DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响,旨在寻找更适合DHPLC分析的DNA聚合酶。方法:选择长度为268bp、317bp、590bp的3个代表性的片段用于DHPLC分析。选择6种品牌的TaqDNA聚合酶,1种Ampli-TaqgoldDNA聚合酶,4种具校正功能的DNA聚合酶(Pfu和Vent),用这11种酶扩增同一DNA片段,并进行DHPLC检测,分析并鉴定它们对DHPLC峰型的影响。结果:TaqDNA聚合酶对DHPLC分析产生两种明显的负面影响。一是在DHPLC图谱的主峰前,形成一个额外小峰,影响DHPLC对杂合双链的分辨能力。另一种影响是难以形成正常的DHPLC色谱图,导致DHPLC检测的失败。具校正功能的DNA聚合酶和TaqgoldDNA聚合酶对DHPLC几乎不产生这些负面影响。结论:具校正功能的DNA聚合酶比Taq聚合酶更适合于DHPLC突变或SNP分析,尤其是GC含量高的小片段或其它容易受干扰的片段应首选PfuDNA聚合酶用于DHPLC分析。

变性高效液相色谱分析检测人类糖皮质激素受体基因变异

目的 :以变性高效液相色谱分析 (DHPLC)检测糖皮质激素受体基因 (NR3C1)在中国人群中的变异情况。方法 :提取 6 4例中国人基因组DNA ,参照文献所报道的引物序列 ,PCR方法扩增糖皮质激素受体基因编码区(2～ 9α外显子 )及其邻近的部分内含子序列 ,琼脂糖凝胶电泳鉴定产物后 ,以DHPLC检测PCR产物 ,对洗脱曲线异常者进行DNA测序。结果 :经DHPLC分析和DNA测序证实 ,研究人群的NR3C1基因中存在 8处变异 ,5处为新发现 ;其中有 2组变异呈紧密连锁的单倍型 ,均为首次报道 ,它们在人群中的基因型频率达 3.1%与 14 .1% ;另一处变异出现频率相对较低。结论 :成功地建立了以DHPLC检测NR3C1基因变异的方法及技术参数 ,证实在中国人群中NR3C1基因存在变异 ,其中 2种频率较高的单倍型为新发现。

变性高效液相色谱检测食品中致泻性大肠杆菌

【目的】应用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中致泻性大肠杆菌的快速检测方法。【方法】分别根据4种致泻性大肠杆菌的特异性毒力因子基因序列设计引物,PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。以肠产毒性大肠杆菌等32株试验菌株做特异性检测;4种致泻性大肠杆菌标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。【结果】试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:肠产毒性大肠杆菌27CFU/mL、肠致病性大肠杆菌33CFU/mL、肠出血性大肠杆菌25CFU/mL、肠侵袭性大肠杆菌42CFU/mL。【结论】该方法可以快速、准确地检测食品中的致泻性大肠杆菌,是食品中病原菌检测的新技术和新方法。

水产品中溶藻弧菌PCR-变性高效液相色谱检测方法的建立

采用DHPLC技术检测溶藻弧菌特异性PCR扩增产物,优化分析条件,探讨其灵敏度特异性,并与传统检测方法进行了比较。试验结果表明,该方法有很好的特异性,灵敏度较高。得到溶藻弧菌PCR-DHPLC特征峰型图,样本检测的峰型图可用于定性或定量监测样本中溶藻弧菌的动态变化。建立的水产品中溶藻弧菌PCR-DHPLC方法具有广泛而良好的适用性。

变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌

应用多重PCR反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquidchromatography,DHPLC)技术建立食品中沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测方法。以编码沙门氏菌的fimY基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码肠出血性大肠杆菌O157:H7的rfbE基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了快速鉴别沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为284、159和499 bp,并验证了该多重PCR具有特异性。沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测。试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:沙门氏菌1.5 CFU/ml、空肠弯曲菌15 CFU/ml、肠出血性大肠杆菌O157:H7 15 CFU/ml。在随机采集的226份冷冻鸡肉类样品中,检出了7份样品为沙门氏菌阳性、10份为空肠弯曲菌阳性、1份为肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性。研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测。

多重连接依赖式探针扩增和变性高效液相色谱法检测Duchenne型肌营养不良症患者DMD基因的缺失/重复突变

目的比较多重连接依赖式探针扩增法（MLPA）和变性高效液相色谱法（DHPLC）检测Duchenne型肌营养不良症（DMD）患者DMD基因缺失／重复突变的效果。方法选择2004年10月-2005年10月在我院确诊的22位无关DMD男性患者，采用MLPA法对经DHPLC技术检测过的患者的DMD基因的缺失／重复突变进行突变筛查，同时对先证者的23位女性亲属进行基因的缺失／重复突变检测。结果DHPLC技术和MLPA法均检测出11位先证者具有DMD基因缺失突变，3位先证者具有DMD重复突变；MLPA法除能更精确地检测出上述突变外，还检测出DHPLC法未检测出的两位患者的DMD基因存在缺失突变。16个家系中18位可能的女性携带者中，12位经检测为缺失／重复突变携带者。两种方法均未检测到6位先证者及其女性亲属DMD基因具有缺失／重复突变。结论与DHPLC法和传统的多重PCR方法相比，MLPA法检测DMD基因的缺失／重复突变位置更为准确。MLPA法可用于检测先证者及家系中女性携带者DMD基因的缺失／重复突变。

变性高效液相色谱——一种新的基因突变检测方法

变性高效液相色谱是近年来发展起来的一种检测基因突变及多态性的新方法。相比其它检测技术 ,它具有易普及、经济、快速等特点。本文对该项技术在国内外近几年的研究进展进行了评述。

变性高效液相色谱在大通量筛查基因突变中的应用

应用变性高效液相色谱(DHPLC)对已知序列的含外显子7的斑马鱼p53基因片段PCR产物进行突变检测,结果表明,通过克隆测序方法检测出的点突变,用DHPLC同样可以检出.且对该片段的最优化检测柱温为60℃,其特异性很好,敏感性大于95%.

应用变性高效液相色谱筛查颅内静脉系统血栓形成AT-Ⅲ基因突变及多态性

目的应用变性高效液相色谱(DHPLC)方法筛查生育期女性颅内静脉系统血栓形成(CVT)AT-Ⅲ基因的突变及多态性。方法标本来自于2006年6月～2007年12月南方医院生育期女性CVT患者,及52例严格配伍的健康女性外周静脉血。提取所有受试者全血DNA,PCR扩增后应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术分析抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)基因的启动子区,第1～6外显子及其侧翼序列的基因变异情况。结果DHPLC技术分析发现病例组出现6种异常峰形,经测序证实1例致病突变为Exon6 G13328A的杂合突变,1例新发现的同义突变Exon4+243G>A;SNP位点6个,其中4个SNP库已报道的SNP位点,2个新发现的SNP位点。对照组发现一种异常峰型(三峰)。结论DHPLC是一种自动、快速、高通量的基因突变及SNP位点的筛查方法,AT-Ⅲ基因突变可能是导致生育期非妊娠女性CVT的遗传因素之一,功能性SNP位点也可能参与了该人群VTE的发生。

变性高效液相色谱检测恶性肿瘤患者血浆 DNA p53突变(英文)

目的 探讨扩增恶性肿瘤患者血浆 DNA的可行性 ,建立一种快速检测血浆 DNA突变的新方法 .方法 选取恶性肿瘤患者共 4 0例 ,采用 Qiagen column柱抽提法提取血浆DNA,采用聚合酶链反应 (PCR)扩增 p5 3基因外显子 7,用变性高效液相色谱法 (DHPL C)对产物进行突变分析 ,并与测序结果比较 .结果 4 0例恶性肿瘤患者血浆提取的 DNA均能扩增出目的片断 ,DHPL C检测到有 8例突变 ,随机送检的 8份 DHPL C未检测到突变者测序也未发现突变存在 ,与 DNA直接测序结果相一致 .结论 对恶性肿瘤患者血浆 DNA行PCR扩增是可行的 ,DHPL C可作为一种快速 ,简便和经济的突变筛选方法 ,运用此方法检测血浆中 p5 3等基因的突变有望应用于恶性肿瘤高危人群的预警和早期诊断以及作为预后参考 .

应用变性高效液相色谱法检测幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性

目的建立DHPLC快速检测Hp对克拉霉素耐药性的新方法。方法抽提56份经纸片琼脂扩散法鉴定为克拉霉素耐药的Hp菌株DNA及其对应的胃粘膜组织标本DNA,通过PCR技术扩增23SrRNA区187bp基因,运用DHPLC技术对PCR产物进行突变分析,并进行DNA测序。结果 56份克拉霉素耐药的Hp菌株DNA经DHPLC分析,有51份存在异源双链峰,测序证实均存在点突变,5份无异源双链峰,测序证实无点突变,故DHPLC对基因突变耐药菌株的敏感性和特异性为100%,而且56份组织标本DNA检测结果与菌株DNA检测结果一致。结论 DHPLC可应用于Hp对克拉霉素耐药性的快速检测,具有广阔的临床应用前景。

变性高效液相色谱法检测多种途径获取的非小细胞肺癌组织表皮生长因子受体基因突变

背景与目的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是最重要的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治疗靶点,EGFR突变可预测酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)的疗效。DNA直接测序是检测EGFR突变最常用的方法,同时也作为突变检测的"金标准",但该方法耗时较长、所需组织量较多且敏感性较低。变性高效液相色谱法是一种快速、自动化、高敏感性的突变检测方法,本研究旨在探讨变性高效液相色谱法(denaturing high-performance liquidc hromatography,DHPLC)快速检测NSCLC肿瘤组织EGFR基因突变的诊断价值。方法通过检测已知按不同比例混合的野生型及突变型EGFR质粒DNA,评价DHPLC法的准确性和敏感性。选取经多种途径获取的83例NSCLC患者的冻存肿瘤组织,提取DNA并PCR扩增EGFR外显子19、21,用DHPLC法检测并与直接测序法进行比较。结果当突变型质粒与野生型质粒按1:100混合时,仍可被DHPLC法显著检出,而直接测序法仅可检出1:10水平。83例NSCLC组织标本中,DHPLC法检出22例EGFR突变(突变率26.51%),3例直接测序法结果为野生型,余19例EGFR突变及61例野生型均与直接测序法结果相符。DHPLC法的敏感度为100%,特异度为95.31%,对经皮细针肺穿刺活检、淋巴结活检以及外科切除等途径获取的肿瘤样本均具有较高的敏感度、特异度。EGFR突变与性别、病理类型显著相关,与吸烟状态、年龄等无相关性。结论 DHPLC法可作为NSCLC患者EGFR基因型的初筛方法。

引物延伸/变性高效液相色谱检测HBV拉米夫定耐药突变

目的建立引物延伸/变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测HBV拉米夫定耐药突变的方法。方法本法只需单条引物一次延伸反应便可检测野生株YMDD型、突变株YIDD和YVDD型。其中,突变株YVDD型被延伸1个碱基(G),突变株YIDD型被延伸4个碱基(ATTG/ATCG),野生株YMDD型被延伸3个碱基(ATG),延伸产物用DHPLC检测长度;构建野生株YMDD型、突变株YIDD型和YVDD型质粒,对方法进行检验;用商品试剂和临床标本对方法进行验证。结果野生株YMDD型、突变株YIDD型和YVDD型克隆质粒验证结果完全符合;临床56例标本的检测结果与商品化试剂(熔解曲线法)结果完全符合。结论引物延伸/DHPLC检测HBV基因拉米夫定耐药突变是一个高特异性、高可靠性的方法。

多重PCR-变性高效液相色谱法快速检测结核致病菌群并同步鉴别致病菌种

本研究旨在运用多重PCR联合变性高效液相色谱(DHPLC)技术原理,建立快速检测人兽结核致病菌群并鉴别主要致病菌种的新方法。建立了四重PCR-DHPLC方法,可同时检测结核分枝杆菌复合群(MTC)特异的IS6110和IS1081插入序列、结核分枝杆菌特异结构基因和牛分枝杆菌特异结构基因共4个目标基因。采用13种分枝杆菌标准菌株和分离株以及23种常见微生物样品进行特异性试验,采用纯化标准菌株DNA以及克隆了扩增序列的重组质粒DNA进行检测灵敏度试验,采用从临床疑似发病牛群采集的牛组织样品进行临床检测试验,并与细菌分离培养方法进行比对。结果表明:所建立的多重PCR-DHPLC方法能特异检测MTC并准确鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌,而对其它11种分枝杆菌以及23种常见微生物样品均呈典型阴性检测结果;检测灵敏度达到每个反应102～103基因拷贝或3.6～6.8fg DNA模板浓度。采用该法从39份临床疑似样品中检出33份MTC阳性并检出其中28份为牛分枝杆菌阳性,而培养法检出21份阳性样品。采用该法临床检测全程可缩短至1d之内,其中对纯化DNA样品的检测分析可在2h内完成。本研究为人兽结核致病菌(群)的快速检测鉴别提供了新型分子生物学方法。

运用变性高效液相色谱技术快速检测肺炎克雷伯菌耐药性

目的通过运用变性高效液相色谱(DHPLc)技术,对前期研究已确认产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的54株肺炎克雷伯菌临床分离株SHV型质粒进行基因分型,探讨其敏感性和特异性,试图建立一种快速检测肺炎克雷伯菌耐药性新方法。方法利用PCR技术从肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出SHV型质粒的编码序列,扩增产物运用DHPLc技术进行分析和DNA测序,确定其基因突变的类型,最后通过比对确定其基因型。结果DHPLc分析样本的阳性率为100%,均表现为形态各异的异常洗脱峰(双峰或三峰);测序结果表明所有样本与SHV-1比较均存在着耐药基因突变;并且DHPLc中异常峰一致的样本均为同一基因亚型。结论本次实验中DHPLc的敏感性高达100%,并且每一种SHV亚型具有特定的洗脱峰型,所以DHPLc可用于细菌耐药基因的分型,能快速检测肺炎克雷伯菌耐药基因的突变,不但准确性较高,而且具有简便快捷、经济等特点,有很大的潜在临床价值。

引物延伸变性高效液相色谱法诊断遗传性非综合征性耳聋

目的建立针对中国人常见的遗传性非综合征性耳聋基因诊断的新方法。方法 PCR扩增的靶序列,经引物延伸,得到中国人遗传性非综合征性耳聋的6个常见突变的特异性延伸片段,用全变性高效液相色谱分析延伸片段混合物,分离图谱可鉴定被检样本的基因型。结果盲法分析显示,120例样品的引物延伸变性高效液相色谱与直接测序检测结果符合率为100%。其中84例耳聋患者诊断为上述6个常见突变中的突变。该法的突变检出率为70%(84/120)。结论该法是一种准确、高效的检测非综合征性遗传性耳聋突变的分析方法,值得推广。

变性高效液相色谱法筛选鼻咽癌相关基因单核苷酸多态性

目的 利用变性高效液相色谱法（DHPLC）结合测序筛选和鉴定鼻咽癌基因的单核苷酸多态性（SNPs）。方法 PCR扩增30例鼻咽癌患者和28例正常对照者6p21.3区域基因PPP1R11、PP1R10、FLOT1、KIAA0170的4个外显子与1个内含子片断,采用DHPLC技术对扩增片断进行基因变异检测,将不同的类型PCR片断进行全序列测定并与参考序列对照分析。结果 在5个片断中初步鉴定出4个未见报道的新SNP位点,验证了4个已知的SNPs位点和基因型。结论 DHPLC预测结合全序列测序是一种高效、经济、简便、可靠的SNP筛选方法。

变性高效液相色谱在检测肝豆状核变性基因突变中的作用

目的 建立变性高效液相色谱 (denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)技术检测肝豆状核变性 (WD)基因第 8外显子突变。方法 利用聚合酶链式反应 (PCR)扩增WD基因第 8外显子片段 ,扩增产物直接进行DHPLC分析 ;对峰型有改变的样品经测序分析确认突变。结果 在 5 1例WD先证者中共发现两种错义突变 (Arg778Leu和Arg778Gln)、一种插入突变 (Ins2 30 2C)和一种多态性位点 (C2 310G)。其中 12例先证者带有Arg778Leu杂合错义突变 ,3例为Arg778Leu纯合错义突变 ,1例为Arg778Gln杂合错义突变 ,1例为杂合 2 30 2C插入突变。多态位点C2 310G与Arg778Leu突变完全连锁。结论 WD基因第 8外显子阳性检出率为 33 3% (17/ 5 1) ,说明DHPLC技术是一种可用于临床WD基因诊断的高效。

运用变性高效液相色谱快速检测CTX-M超广谱β内酰胺酶基因型

目的直用变性高效液相色谱(DHPLC)技术对确认产 ESBLs 的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株 CTX-M 型质粒酶进行基因分型,探讨其灵敏度和特异度,以建立快速检测 CTX-M 型 ESBLs 的新方法。方法采用 PCR 技术从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出 CTX-M 型质粒的编码序列,用 DHPLC 技术对扩增产物进行分析和 DNA 测序,确定其基因突变的类型,通过比对两者结果后确定其基因型。结果从34株产 ESBLs 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌临床分离株中扩增出35份 CTX-M 型 ESBLs 编码序列(其中1株同时扩增到2份 CTX-M 型编码序列)。11份与标准菌株 CTX-M-3一致:4份与标准菌株 CTX-M-9一致;测序确定分别为 CTX-M-3型和 CTX-M-9型:20份表现为3种形态各异的异常洗脱峰,测序结果表明20份样本与其标准株对比均存在着基因突变,DHPLC 中异常峰一致的样本均为同一基因亚型。结论 DH-PLC 可用于 ESBLs 基因分型的检测,能快速检测 CTX-M 的基因型,具有准确性高、简便快捷、经济等特点,有很大的临床应用价值。