变性高效液相色谱技术在大豆品种鉴定中的应用

单核苷酸多态性(SNPs)和插入-删除标记(In Del)在基因组中广泛分布,日益成为主要作物的重要遗传标记。利用变性高效液相色谱(DHPLC)技术检测大豆品种的SNP和In Del的多态性,可为大豆种质的品种鉴定提供一种新型的快速检测方法。基于公共数据库中的大豆基因信息,筛选了3条DNA序列作为目标分析片段,以大豆种质粤夏119作为参比基因型,利用DHPLC技术平台对10份大豆品种进行了鉴定。结果表明:混合参比DNA后的大豆样本产生DHPLC谱图均具有多态性,谱型与测序基因型一一对应。综合3条目标片段的DHPLC特征谱图可以区分所有大豆品种。试验结果验证了DHPLC应用于大豆品种鉴定的可行性和可靠性。由于DHPLC分辨率高、快速、操作简单、安全等优点,在大豆的品种鉴定中具有良好的应用前景。

变性高效液相色谱分析技术对乳腺癌易感基因突变位点检测的敏感性和特异性

目的探讨变性高效液相色谱分析技术对乳腺癌易感基因突变位点检测的敏感性和特异性。方法收集202例诊断为原发性乳腺癌女性患者,同时采用PCR/DNA测序法和变性高效液相色谱分析技术检测对所有患者进行BRCA1基因突变的筛查,以PCR/DNA测序法作为金标准,评估变性高效液相色谱分析技术的敏感性和特异性。结果本研究202例乳腺癌标本中,PCR/DNA测序法发现BRCA1基因突变例数为76例,变性高效液相色谱分析技术结果也为阳性例数为73例,敏感性为96.1%;PCR/DNA检测结果为阴性的总共126例标本,采用变性高效液相色谱分析技术,结果也为阴性的总标本例数为120例,特异性为95.2%。两种检测方法敏感性(100%vs 96.1%,P=0.265)和特异性(100%vs 95.2%,P=0.226)无统计学差别。结论与传统检测方法相比采用变性高效液相色谱分析技术检测乳腺癌易感基因BRCA1具有较高的敏感性和特异性,值得推广。

变性高效液相色谱技术在快速检测食品微生物中的应用研究

食品安全问题一直是社会各界重点关注的热点话题。为了保证食品质量和安全,有必要对流入市场的食品进行食品中微生物含量的检验。变性高效液相色谱技术因其自身特点以及检验的精确度相对较高、灵敏度和速度相对较快等特点,在微生物检测方面得到了广泛应用。本文主要对变性高效液相色谱技术的实际应用进入深入研究,从原理、特点等方面进行详细阐述。

DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响

背景与目的:变性高效液相色谱(denaturinghigh-performanceliquidchromatography,DHPLC)是最近发展起来的一种灵敏而高通量的基因突变检测技术,在工作中我们发现某些因素,尤其是DNA聚合酶干扰DHPLC分辨力。本文详细地分析了具校正功能和非校正功能的DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响,旨在寻找更适合DHPLC分析的DNA聚合酶。方法:选择长度为268bp、317bp、590bp的3个代表性的片段用于DHPLC分析。选择6种品牌的TaqDNA聚合酶,1种Ampli-TaqgoldDNA聚合酶,4种具校正功能的DNA聚合酶(Pfu和Vent),用这11种酶扩增同一DNA片段,并进行DHPLC检测,分析并鉴定它们对DHPLC峰型的影响。结果:TaqDNA聚合酶对DHPLC分析产生两种明显的负面影响。一是在DHPLC图谱的主峰前,形成一个额外小峰,影响DHPLC对杂合双链的分辨能力。另一种影响是难以形成正常的DHPLC色谱图,导致DHPLC检测的失败。具校正功能的DNA聚合酶和TaqgoldDNA聚合酶对DHPLC几乎不产生这些负面影响。结论:具校正功能的DNA聚合酶比Taq聚合酶更适合于DHPLC突变或SNP分析,尤其是GC含量高的小片段或其它容易受干扰的片段应首选PfuDNA聚合酶用于DHPLC分析。

变性高效液相色谱在结核分枝杆菌耐药性检测中的应用研究

目的应用变性高效液相色谱技术(DHPLC)检测结核分枝杆菌(MTB)对乙胺丁醇(EMB)、吡嗪酰胺(PZA)耐药相关基因embB,pncA的突变情况,探讨DHPLC在MTB耐药性检测中的应用价值。

应用变性高效液相色谱技术快速诊断儿童型脊髓性肌萎缩症(英文)

目的介绍变性高效液相色谱(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)技术在儿童型脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA)基因诊断中的应用。方法PCR扩增25名正常人、1份标准样品及25例SMA患者运动神经元生存基因(survivalmotorneuron,SMN)第7外显子及其侧翼区域,PCR产物变性、复性后直接上样于DHPLC系统。通过改变A、B缓冲液的比例来分离各种DNA成份。结果各种不同DNA成份以色谱峰的形式表现出来。23名正常标本呈现3个峰,依次为SMN1/SMN2异源双链峰、SMN2同源双链峰、SMN1同源双链峰。2名正常标本及1份标准品只有SMN1峰,表明缺失了SMN2。22例SMA患者只有SMN2峰,表明缺失了SMN1。另3例SMA患者呈现3个峰,表明无SMN1或SMN2缺失。结论DHPLC诊断SMA具有敏感、准确、快速、简便等优点。

应用变性高效液相色谱技术筛查一个正常血钾性周期性麻痹家系的SCN4A基因突变

目的 应用变性高效液相色谱 (DHPLC)技术筛查一发生Met15 92Val替换的正常血钾性周期性麻痹 (normoKPP)家系的SCN4A基因 ,证实该突变为疾病相关突变 ,并总结其在此家系的临床表型特点。方法 总结一normoKPP家系 14例患者的临床特点 ,应用DHPLC技术筛查SCN4A基因全部 2 4个外显子 ,并对发现异常洗脱峰者进行测序。结果 该家系具有典型的normoKPP临床特征 ,无肌强直表现及早显、性别偏移现象 ,病程呈良性过程 ,发病早晚与症状严重程度及预后无相关。DHPLC筛查发现在外显子 1及 2 4存在杂合二倍体 ,测序及连锁分析证实位于外显子 1的突变为良性多态性 ,外显子 2 4的Met15 92Val替换为疾病相关突变。结论 国人存在Met15 92Val突变 ,此突变可导致normoKPP。normoKPP与高钾性周期性麻痹临床表现相似 ,两者可存在共同突变。

运用DHPLC技术进行脊髓性肌萎缩症SMN-T基因缺失检测的初步研究

目的评价变性高效液相色谱技术(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)在脊髓性肌萎缩症(spinalmuscularatrophy,SMA)端粒运动神经元生存基因(survivalmotorneurontelomericcopy,SMN-T)缺失筛查中的应用价值。方法应用扩增限制性长度多态性技术(PCR-RFLP)、DHPLC及DNA测序技术对51例SMA患儿及其双亲与67例非SMA患儿SMN-T与着丝粒运动神经元生存基因(survivalmotorneuroncentromericcopy,SMN-C)碱基差异位点exon7(C/T)与exon8(G/A)进行检测。结果PCR-RFLP与DHPLC技术均同时检出45例SMA患儿SMN-T基因exon7+8或exon7纯合缺失,DNA测序证实了PCR-RFLP与DHPLC检测的可靠性。在DHPLC检测中发现,6例非SMN-T纯合缺失患儿的SMN-T与SMN-C基因拷贝数存在不平衡;在SMN-T基因纯合缺失患儿双亲中,75.5%(77/102例)的个体两基因拷贝数存在不平衡;在非SMA对照组中,22.4%的个体(15/67例)两基因拷贝数存在不平衡,两组个体基因拷贝不平衡频率差异有显著性。结论DHPLC技术不仅能快速有效地检出SMN-T基因的纯合缺失,而且通过比较SMN-T与SMN-C基因拷贝数平衡与否,可初步提示患儿SMN-T基因杂合缺失状态与双亲基因缺失的携带者状态,为进一步的基因突变筛查与产前诊断提供依据。

变性高效液相色谱技术在家族性高胆固醇血症低密度脂蛋白受体基因点突变检测中的应用

目的以变性高效液相色谱(DHPLC),分析检测家族性高胆固醇血症(FH)一汉族家系成员的低密度脂蛋白受体(LDLR)基因突变,以明确诊断。方法收集临床诊断为家族性高胆固醇血症的汉族一个家系共37名成员,其中30人为一级和二级亲属,7名为亲属配偶作为对照,提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)方法扩增LDLR基因包含启动子和全部基因编码区(118外显子)及临近的内含子序列共21个片段,琼脂糖凝胶电泳鉴定产物。采用DHPLC技术检测了LDLR基因,对洗脱曲线异常者进行核苷酸序列分析。结果该家系中发现4处变异,其中1处经核苷酸序列测定明确了突变的性质为第3内含子的剪接突变,并在此家系5名成员中得到证实,而对照组中未检出。结论成功地建立了以DHPLC筛查LDLR基因点突变的方法及技术参数,该方法简便,结果稳定,可作为大样本筛查突变位点的一种便捷可靠手段。

动物病原高通量检测技术

当前规模化养殖业迫切需要动物病原检测技术高通量化。高通量检测技术具有高通量、自动化、微量化等特点。病原高通量检测技术可分为高通量免疫学检测(检测抗原)和高通量分子生物学检测(检测核酸)两大类。论文对近年来报道的用于动物病原高通量检测的基因芯片技术、抗体芯片技术、液相芯片技术、流式细胞术多色荧光分析技术、变性高效液相色谱技术等新技术从原理、特点及应用等进行了综述。

变性高效液相色谱技术检测PAI-1基因多点突变与冠心病相关分析

目的 检测纤溶酶原激活物抑制剂 -1(plasminogen activator inhibitor-1;PAI-1)基因编码区多态性 ,并探讨其与冠心病的关系。方法 使用变性高效液相色谱 (denaturing high performance liquidchromatography,DHPL C)技术和 DNA序列测定方法检测了 93例冠心病 (coronary artery disease,CAD)患者和 12 3名正常对照者的基因组 DNA。结果 在 PAI-1基因第 2外显子中发现了两个单核苷酸多态性位点 (G43 A和 G49A)均为鸟嘌呤 (G)→腺嘌呤 (A)突变 ,引起肽链上第 15位丙氨酸变成苏氨酸(Ala15Thr)和第 17位的缬氨酸变成异亮氨酸 (Val17Ile) ,在所有对象中只发现了杂合型和纯合野生基因型携带者。分别分析了两个位点基因型与冠心病和 PAI-1基因水平的关系。与冠心病组比较 ,对照组中具有更多的杂合基因型携带者 ,但差异无显著性。其不同基因型与 PAI-1抗原水平没有明显相关性。结论 用 DHPL C技术检测了 PAI-1基因两个多态性位点 。

应用悬浮点阵和变性高效液相色谱技术检测β地中海贫血基因的比较

目的比较悬浮点阵技术(suspension array,SA)及变性高效液相色谱技术(DHPLC)在β-地中海贫血及基因分型诊断中的应用。方法通过分析100例正常人标本和69例经PCR反向斑点杂交技术(PCR-RDB)确认的β-地中海贫血患者外周血DNA标本,经PCR扩增并分别运用SA及DHPLC两种方法对其进行基因分型诊断。结果100例正常人标本结果为阴性,69例β-地中海贫血标本经两种方法检测其缺失和突变的基因型别完全一致,其中单位点基因突变65例,多位点基因突变4例。结论两种检测技术在β-地中海贫血基因分型诊断中准确性完全一致,具有快速、高效、检测平台的通用性的共同点;但悬浮点阵技术在临床标本检测具有更高的优势,变性高效液相色谱技术则可检测未知突变,在基础研究方面具有优势。

食品微生物检验内容及检测技术研究

随着我国综合国力的不断发展,社会生产力不断提高,人们的生活也变得越来越富裕,对美味食品的追求越来越高,在吃上投入的资金越来越多。鉴于此,一些不良商家以次充好、以假乱真,使食品安全问题频发,严重影响食品市场的正常秩序,随着一系列食品安全问题的发生,食品安全问题引起全社会的高度重视。为保证人民的人身安全,必须加大对食品安全检测的检测力度。

CYP2C19基因型对丙戊酸及其与苯妥英联合用药时血药浓度影响

目的 探讨细胞色素P450 2C19(CYP2C19)基因对丙戊酸(VPA)血药浓度,以及VPA和苯妥英(PHT)联合应用时对其VPA血药浓度的影响。方法 应用变性高效液相(DHPLC)技术对CYP2C19两个常见的等位基因突变进行了分析;应用荧光偏振免疫法(FPIA)测定口服抗癫痫药物患者的血药浓度。结果 81例癫痫患者中CYP2C19外显子4(*3)和外显子5(*2)位点均为野生型(*1/*1)的发生率为37.0％,CYP2C19*2和CYP2C19*3的等位基因频率分别为31.5％和3.7％。单一应用VPA时,弱代谢患者较正常代谢患者的VPA血药浓度有所升高(P<0.05)。联合应用PHT和VPA可使VPA血药浓度显著降低(P<0.01),CYP2C19正常代谢患者VPA血药浓度降低尤为明显(P<0.01);在VPA与PHT联合用药过程中,约半数CYP2C19正常代谢患者VPA血药浓度不能达到治疗血药浓度。结论 CYP2C19基因多态性影响VPA的血药浓度变化,在联合应用PHT时对VPA血药浓度的影响尤为明显,从而影响抗癫痫的临床疗效。

胃癌细胞色素氧化酶CYP3A4基因多态性与含紫杉醇方案化疗敏感性的研究

目的探讨胃癌细胞色素氧化酶CYP3A4基因多态性与含紫杉醇方案化疗敏感性的关系。方法采用变性高效液相色谱技术（DHPLC）和基因测序技术检测53例晚期胃癌患者外周血中CYP3A4基因的突变情况，观察并评价含紫杉醇化疗方案的疗效与CYP3A4基因多态性的关系。结果DHPLC检测显示，53例胃癌患者中CYP3A4基因单峰者（野生型）32例，双峰者（突变型）21例；测序结果显示，CYP3A4基因第10号外显子第27位C缺失突变。野生型组有效率（RR）为40．6％，疾病控制率（DCR）为84．4％；突变型组RR为33．3％，DCR为85．7％，两组RR和DCR的差异均无统计学意义（P〉0．05）。53例胃癌患者的中位无进展生存时间（PFS）为6．5个月（95％CI：3．576～9．424个月），中位总生存时间（OS）为11．0个月（95％CI：6．955～15．045个月）。CYP3A4野生型与突变型患者中位PFS（7．0个月掷．7．0个月）和OS（10．0个月vs．14．0个月）的差异均无统计学意义（P〉O．05）。使用含铂方案患者CYP3A4基因野生型和突变型中位PFS的差异无统计学意义（P〉0．05），使用非含铂方案中位PFS的差异有统计学意义（p=0．024），含铂与非含铂方案中位0s的差异均无统计学意义（P〉0．05）。采用3药联合与两药联合方案患者的中位PFS和0s均与CYP3A4基因多态性无关。野生型与突变型患者不良反应均较轻，以1～2级为主，常见不良反应包括食欲减退、恶心呕吐和白细胞减少。结论CYP3A4基因第10号外显子第27位C缺失突变，CYP3A4基因突变型晚期胃癌患者使用含紫杉醇方案有延长0s的趋势。

急性髓细胞白血病FLT3-ITD基因突变的检测及其临床意义

目的探讨急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者人Fms样酪氨酸激酶3内部串联重复(Fms-like tyrosine kinase3-intenal tandem duplication,FLT3-ITD)基因突变及其临床意义。方法采用聚合酶链反应-变性高效液相色谱(polymerase chain reaction-denaturing high performance liquid chromatography,PCR-DHPLC)方法检测60例初治AML患者和10例对照组骨髓FLT3-ITD基因突变。结果60例AML患者FLT3-ITD突变阳性率21.67%(13/60),10例对照组均未检测到该突变;FAB各亚型FLT3-ITD突变率不同,有M3型突变率较高的趋势;FLT3-ITD阳性组外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高于FLT3-ITD阴性组(P<0.01);FLT3-ITD阳性组完全缓解(CR)率低于FLT3-ITD阴性组(P<0.05)。结论FLT3-ITD基因突变多见于M3患者,FLT3-ITD阳性者具有外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高、CR率低的特点。FLT3-ITD基因突变可作为预测AML预后的一个指标。

急性髓细胞白血病FLT3-ITD基因突变与细胞遗传学的关系

目的探讨急性髓细胞白血病(AML)FLT3-ITD基因突变与细胞遗传学关系.方法采用PCR-DHPLC方法检测60例初治AML患者骨髓单个核细胞FLT3-ITD突变;应用G显带技术进行核型分析.结果 60例初发AML中,FLT3-ITD突变阳性率为21.67%(13/60);10例对照组均未检测到该突变;不同预后核型组FLT3-ITD突变阳性率不同,预后中等核型组突变率较高40.0%(6/15),预后中等核型组FLT3-ITD突变阳性者外周血白细胞数、骨髓白血病细胞比例高于预后好核型组及预后差核型组(P<0.01).结论 FLT3-ITD突变在AML中多发生于预后中等核型组,而且与预后不良相关;预后中等核型组FLT3-ITD突变阳性者具有外周血高白细胞、骨髓白血病细胞比例高的临床特点.FLT3-ITD突变检测在一定程度上可以弥补细胞遗传学的不足,有可能成为AML常规检测项目之一,有助于白血病的诊断及预后判断.

4568例孕妇脊髓性肌萎缩症携带者筛查及产前诊断分析

目的:对4568例孕妇进行脊髓性肌萎缩症(SMA)突变携带者筛查,并对已明确携带者夫妇胎儿进行产前诊断,了解运动神经元生存基因(SMN)变异携带率及SMA产前诊断并分析临床意义。方法:将变性高效液相色谱(DHPLC)分析法及Sanger测序联合应用,对石家庄市第四医院4568例孕妇进行SMN1缺失/点突变检测,进行携带频率统计;对携带者配偶进行筛查并对双方均为携带者夫妇胎儿进行产前诊断。结果:(1)4568例孕妇共检出SMA患者3例,2例SMN1外显子7纯合缺失,1例患者检测出SMN1外显子杂合缺失,拷贝数"1",该患者同时检出SMN1点突变变异位点p.Q164X,临床诊断为"1+1型"SMA患者,发病率0.066%。(2)126例拷贝数异常携带者(SMN1杂合缺失/转换个体),84例为缺失携带者,含SMN1∶SMN 2=1∶1样本35例,SMN1∶SMN 2=1∶2样本49例。35例转换携带者SMN1转换成SM N 2基因,含SMN1∶SMN 2=1∶3样本32例,SMN1∶SMN 2=1∶4样本3例。7例携带者SMN1∶SMN 2=1∶0。(3)126例携带者配偶中25例同为携带者。(4)应用DHPLC联合Sanger测序技术对25例SMA高危胎儿行产前诊断。结果显示3例胎儿SMN1外显子7/8纯合缺失(SMA患者);1例胎儿SMN1外显子7/8杂合缺失(SMA携带者)。余胎儿检测未见SMN1拷贝数异常。Sanger测序1例胎儿携带p.Q164X点突变变异位点,余样本未见SMN异常。结论:本研究检出SMN1变异携带率高于中国南方地区报道,且在北方地区属高携带率地区。DHPLC联合Sanger检测技术可以完成SMA携带者筛查及产前诊断,二者联合应用对于优生优育、有效预防SMA胎儿的出生具有重要的临床意义。