基于体温扩增的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种3种可视化快速检测方法的建立

为实现食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)的快速检测,基于体温扩增技术——酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA),并根据唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种bonM基因序列设计和筛选了ERA检测引物和探针,分别建立ERA显色法、荧光法、试纸条法3种可视化快速检测方法,并评估其特异性和灵敏度,以及在市售样品检测适用性和准确性。结果显示,建立的方法对3株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病型菌株均有扩增,其他常见的食源性致病菌以及其他唐菖蒲伯克霍尔德氏菌均无扩增,说明检测方法的特异性良好。3种方法的检出限均为10^(-2)ng/μL,灵敏度较好。采用建立的3种可视化快速检测方法对15份市售样品进行检测,检出阳性2份,检出率为13.3%。该结果与国标方法的检测结果一致,说明方法具有较好的适用性和准确性。本研究建立的基于体温扩增技术的显色法、荧光法和试纸条法具有较高的特异性及灵敏度,37℃体温扩增15 min左右即可获取检测结果,且裸眼可视,可为食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒致病变种的现场可视化快速筛查提供新型简便的策略。

吉林省白粉菌属叉丝壳组新记录变种与新寄主

记录了采自长春地区的白粉菌属叉丝壳组(Erysiphe sect. Microsphaera)吉林省新记录变种2个:万布白粉菌原变种(E. vanbruntiana var. vanbruntiana)和车轴草白粉菌原变种(E. trifolii var. trifolii),其寄主东北接骨木(Sambucus manshurica Kitag.)和海滨米口袋(Gueldenstaedtia maritima Maxim.)为世界新寄主,根据标本对其进行了详细的形态描述、显微照相和分析讨论。

泰山硫磺菌硫磺原变种的生物学特性研究

对泰山硫磺菌硫磺原变种ts菌株生物学特性研究结果表明,以葡萄糖为碳源和以蛋白胨为氮源的培养基最有利于菌丝生长,最佳培养基配方为200 g马铃薯+2.5%葡萄糖+0.2%蛋白胨+0.2%磷酸二氢钾+0.1%硫酸镁+20 g琼脂+1 000 ml水,菌丝生长适宜温度为25～30℃,适宜pH为4～6。

金龟子绿僵菌小孢变种对筛胸梳爪叩甲幼虫致病力的生物测定

从筛胸梳爪叩甲Melanotus cribricollis僵死幼虫体内分离得到1株金龟子绿僵菌小孢变种Metarhizium anisopliae var.anisopliae菌株WP,首次采用拌土法对该菌寄生筛胸梳爪叩甲幼虫的致病力进行测定,并分析外界条件对绿僵菌致病力的影响。在WP菌株1×104~1×107孢子/g干土7个孢子浓度梯度下,随着浓度的提高,筛胸梳爪叩甲的校正死亡率从20%上升至100%。在15、20、25、30℃4个温度下,该菌对筛胸梳爪叩甲的致死率随着温度升高而上升。30℃时,筛胸梳爪叩甲死亡率达96.7%;当降至15℃,筛胸梳爪叩甲不会被寄生。在6%~18%土壤湿度条件下,土壤湿度的升高会提高WP菌株对筛胸梳爪叩甲的致死率,6%的土壤湿度不会导致该虫染病。

茄根腐病致病病原——茄病镰刀菌及其蓝色变种的生物学特性研究

对造成天津地区茄根腐病严重为害的茄病镰刀菌F0 2 6[Fusariumsolani(mart.)Sacc.]和茄病镰刀菌蓝色变种F0 12 [Fusariumsolanivar.coeruleum(Sacc.)Booth]进行了系统的生物学特性研究。研究结果表明,不同培养基对 2种病原菌的生长、孢子着生等产生不同程度影响。2 6～ 30℃间适于此两种病原菌的生长,低温( <2 0℃)或高温( >35℃)均会对孢子产生及萌发产生抑制作用,尤其是高温甚至会造成孢子畸形;pH在 5～ 8之间适于病原菌的生长;N、P。

嗜热子囊菌光孢变种β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析

从嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)RNA中通过RT-PCR克隆出β-葡萄糖苷酶基因bglⅠ的全长序列,cDNA序列为2672bp,Genbank登录号为EU269025,将该片段插入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K/bgl,经线性化后用电穿孔法导入毕赤酵母GS115中,在醇氧化酶AOX1基因启动子作用下,获得高效表达β-葡萄糖苷酶的毕赤酵母工程菌株.经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析纯化了该重组表达蛋白.SDS-PAGE测得该重组蛋白相对分子质量(Mr)约为120×103.经甲醇诱导,培养基中β-葡萄糖苷酶的活力可达1.2U/mg,小规模发酵量达0.45mg/mL.该酶的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5.0.于70℃保温30min仍保持80%的酶活力,具有较高的热稳定性,在pH3.0～9.0的条件下酸碱耐受性强.

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的遗传多样性及进化关系

猕猴桃细菌性溃疡病是一种严重威胁猕猴桃生产的毁灭性病害,在世界各大猕猴桃产区发病严重。引起该病的病原菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae,Psa)。综合当前国内外关于该病原菌的相关研究,就其分类地位、遗传多样性及起源进化等方面进行了系统综述。

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporusβ-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性研究

采用室内培养、测定方法,对嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus产生的β-葡萄糖苷酶进行了分离纯化及特性研究。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的β-葡萄糖苷酶。结果表明,经12%SDS-PAGE测得酶的单亚基分子量约为118kDa,凝胶过滤层析测得酶的分子量约为350kDa。该酶反应的最适温度和最适pH分别为80℃和4.5￣5.0,在pH5.0条件下,该酶在70℃条件下基本稳定,80℃保温30min,剩余酶活为15%。金属离子对β-葡萄糖苷酶活性影响较大,其中Ca2+、Ba2+对酶有激活作用;Ag+、Fe3+、Cu2+对酶有显著的抑制作用。该酶对水杨苷具有很强的底物特异性。

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus内切β-葡聚糖酶的分离纯化及特性

采用培养分离、室内测定等方法,对嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus产生的内切β-葡聚糖酶进行了分离纯化及特性研究.粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的内切β-葡聚糖酶.结果表明,经12%SDS-PAGE测得酶的单亚基分子量约为31.5 kD,凝胶过滤层析测得酶的分子量约为34.5 kD.该酶反应的最适温度为55℃,最适pH为2.5～3.0.该酶在pH3.0条件下60℃较为稳定;80℃保温30 min有20%原酶活性.金属离子对内切β-葡聚糖酶活性影响较大,其中K+、Ca2+、Mn2+对酶有激活作用;Ag+、Cu2+、Al3+对酶有显著抑制作用.该酶对羧甲基纤维素具有很强的底物特异性.

福氏菌Y变种脂多糖的分离纯化及与其它志贺氏菌群的交叉反应

据Carlin等(1987)报道用福氏菌Y变种免疫BALB/C小鼠产生的McAb对福氏菌各型及痢疾志贺氏Ⅰ型菌均可发生反应,并推测诱发产生这种抗体的因子存在于菌体细胞壁脂多糖链上.探明福氏志贺氏菌Y变种脂多糖是否确实存在并与志贺氏菌其它群及型的抗血清发生反应的凝集原性,对研究痢疾血清学诊断方法及研制痢疾菌均有重大意义.为此,我们在对福氏志贺氏菌Y变种脂多糖进行分离纯化的基础上,选择了部分不同型别的志贺氏菌免疫血清与之作间接血凝试验.现将结果报告如下.

嗜热子囊菌光孢变种内切葡聚糖酶I基因在毕赤酵母中的表达及部分酶学性质

嗜热子囊菌是一种嗜热真菌,可以产生具有很高工业价值的内切葡聚糖酶.本研究成功表达了嗜热子囊菌内切葡聚糖酶Ⅰ基因,并获得热稳定的重组内切葡聚糖酶.提取嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)总RNA,通过RT-PCR方法克隆出内切-β-葡聚糖酶eg1基因的成熟肽编码序列.采用基因重组的方法构建该基因的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K-eg1,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母GS115中,大量筛选后获得高效表达内切葡聚糖酶Ⅰ的毕赤酵母工程菌株GpN24.该菌株采用甲醇诱导120h后,内切葡聚糖酶Ⅰ的活力可达570.7U/mL,最适温度为55℃,在90℃的条件下保温30min后仍具有60%的酶活力;最适pH为5.0,在pH3.0～5.0的条件下酶活力保持稳定.

萨克拉普奇尼亚菌串孢变种对南方根结线虫卵和雌虫的致病性

根结线虫卵和雌虫的寄生真菌对根结线虫病害生物防治具有很大应用潜力。本项研究采用分离自北方根结线虫卵的萨克拉普奇尼亚菌串孢变种Pochonia suchlasporia var.catenata CFCC84965,测定其对南方根结线虫卵和雌虫的致病性。被寄生的卵内充满菌丝且胚胎破坏,胚前发育期的卵对菌丝的侵染敏感,即将孵化出2龄幼虫的卵很少被寄生。菌丝环绕于被寄生卵周围形成致密菌网和侵染钉,卵壳皱缩和凹陷,有时可见到菌丝上形成瓶梗细胞和分生孢子;卵胚胎发育停止和幼虫发育畸形,卵内容物聚集变态,卵壳破裂,内容物外渗。萨克拉普奇尼亚菌串孢变种CFCC84965对卵的寄生率为65.18%。该菌对南方根结线虫雌虫具有致病性,菌丝接触雌虫体壁形成侵染钉,穿透体壁,虫体皱缩变形。该菌对根结线虫雌虫的寄生致病是首次报道。

番茄SlβCA3在防御丁香假单胞菌番茄致病变种中的功能

【背景】在全球气候变化的背景下,大气CO_(2)浓度的升高会影响植物病害的发生,进而影响农业生产。β型碳酸酐酶(βcarbonic anhydrase,βCA)是植物CO_(2)感应和浓缩系统中的重要组成元件,参与拟南芥和烟草的植物免疫过程,但在番茄(Solanum lycopersicum)等园艺作物中的研究较少。【目的】通过探究番茄SlβCA3在抵御植物病害中的作用及机制,为番茄生产中的抗性调控提供科学依据。【方法】以拟南芥AtβCA氨基酸系列为参考序列,在番茄Sol genomics network数据库中鉴定到4个SlβCA。进一步以野生型(wild-type,WT)番茄‘Ailsa Craig’(AC)为材料接种丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000,Pst DC3000),利用qRT-PCR技术测定叶片中SlβCA的表达量,筛选出受Pst DC3000诱导表达的基因SlβCA3。在此基础上,以AC为背景,利用农杆菌介导法进行番茄遗传转化,构建SlβCA3稳定过表达植株(OE-SlβCA3)。通过观察OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000后的抗性表型,明确SlβCA3在番茄抵御Pst DC3000过程中的作用。为了研究SlβCA3调控植物抗病性的内在机制,比较WT和OE-SlβCA3植株接种Pst DC3000与对照条件下转录组的变化,并利用KEGG数据库对差异基因进行功能分析,推测糖代谢与SlβCA3介导的免疫反应有关。最后,通过测定WT和OE-SlβCA3植株糖代谢及其信号途径相关基因表达量以及葡萄糖、果糖和蔗糖含量,对转录组结果进行验证及分析。【结果】OE-SlβCA3植株对Pst DC3000的抗性增强,接种Pst DC3000后,叶片中的细菌生长量、病斑数以及死细胞积累量明显减少。转录组测序结果显示,正常条件下,OE-SlβCA3植株转录谱没有发生明显变化;接种Pst DC3000后,在WT和OE-SlβCA3植株中检测到2100个Pst DC3000诱导基因,其中有63.3%的基因在OE-SlβCA3植株中表达量更高。KEGG分析结果显示,依赖于SlβCA3过表达的Pst DC3000诱导基因富集在糖代谢相关路径中,包括淀粉和蔗糖代谢,内质网中的蛋白质加工(糖基化),氨基糖和核苷酸糖代谢,真核生物中的核糖体生物合成以及光合作用等路径。糖代谢与糖信号密不可分,qRT-PCR及糖含量测定结果显示,接种Pst DC3000后,OE-SlβCA3植株叶片中糖代谢及其信号传导途径相关基因表达量与葡萄糖、果糖和蔗糖的含量较WT更高。【结论】番茄SlβCA3的过表达增强了植株对Pst DC3000的抗性,该过程可能与糖代谢及其信号通路在植物免疫中的作用有关。

1株三型丁香假单胞菌猕猴桃致病变种细菌全基因组扫描图测序及分析

丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,简称Psa)是引起猕猴桃细菌性溃疡病的病原菌。对从感染溃疡病的东红猕猴桃枝条中分离得到的1株Psa野生株(命名为GX05)进行全基因组测序,获得基因组草图,分析其中毒力基因、耐药基因和致病基因的情况。研究发现,多位点序列分型结果显示GX05为biovar 3,与毒力因子数据库比对,GX05携带99种毒力因子及692个相关毒力基因,同源性和匹配度最高的毒力因子是PvdL和Irp1;与综合抗生素抗性基因数据库比对,GX05携带336种耐药基因,与29种抗生素有关;与病原宿主互作数据库比对,不表达导致病原菌致病力减弱的基因数量最多,其中同源性和匹配度最高的是PvdL,此外与增强致病力相关的同源性和匹配度最高的基因是hrcC。通过全基因组测序信息初步分析了1株三型Psa菌株中存在的毒力、耐药及致病基因情况,对深入研究其致病机制和合理用药有重要意义。

一株特殊福志贺菌Y变种分离鉴定

由志贺菌属引起的细菌性痢疾在我国法定传染病中占重要地位，至今仍是危害人民健康的最严重的疾病之一，2005年4月在我县某个体糕点厂的蛋糕里检出一株福志贺菌Y变种。由于此菌具有特殊性，一些生物学性状并不典型，故对此菌作详细试验．现将检测结果报告如下。

中国鸡油菌属一新记录—鸡油菌鳞盖变种(英文)

During a taxonomic revision on cantharelloid fungi in China, Cantharellus cibarius var. squamosus A. P?ll apud J. Murr, a new Chinese record was confirmed base on four collections. The paper provides full description and illustration of the variety, and relative information about

唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种污染调查及其生长与产毒特性分析

唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病种(Burkholderia gladioli pathovar cocovenenans,BGC)是迄今我国发现的发病率和死亡率最高的食源性致病菌。为调查广州市市售湿米面制品、银耳及木耳中BGC的污染状况,同时掌握在不同培养条件下BGC的生长与产毒规律,依据GB 4789.29-2020对100份食品样品进行定性分析;通过测定BGC菌株在各培养条件下菌液的OD600值和毒素含量,分析了不同的温度、时间、pH及NaCl浓度下BGC的生长状况与产毒能力。结果表明,100份食品样品中共检出1份(湿木耳)BGC阳性样品,污染率为1%(1/100);BGC的生长与产毒受培养基的影响较大,碱性(pH值为9.5~10.5)与一定渗透压(NaCl质量浓度为0.02~0.04 g/mL)环境下,BGC在马铃薯葡萄糖水中能生长,而在脑心浸液肉汤中几乎不生长,BGC在马铃薯半固体琼脂中的产毒量(231.24μg/mL)远大于BHI半固体琼脂和LB半固体琼脂;BGC适宜生长和产毒的温度为20~37℃、适宜pH值为4~8.5,其中最适生长温度与pH值分别为37℃、6.0,最佳产毒温度与pH值为30℃、7.0;BGC在低温(4~15℃)下仍能存活,且有少量的毒素产生(2.11μg/mL);当NaCl质量浓度为0.005 g/mL时,产毒量从未添加前的139.80降至52.27μg/mL,达到0.04 g/mL时,产毒为0。结果提示,广州市市售木耳中存在BGC污染的风险,在食品加工或贮存过程中添加一定浓度的NaCl可减少由BGC引起的食物中毒。

丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000甘油激酶基因的克隆与功能研究

为研究丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pathovar tomato,Pst)DC3000甘油激酶(Glycerol kinase,GK)的功能,根据Gen Bank中登录的Pst DC3000 GK氨基酸序列设计引物,克隆了Pst DC3000 GK基因,对其生物信息学特征进行分析,然后构建了GK基因敲除突变体,探讨其对菌体生理特性的影响。序列分析表明,GK基因全长1 506 bp,可编码一条501个氨基酸的多肽。生物信息学分析结果显示,Pst DC3000 GK蛋白分子质量55.8 ku,等电点5.54,富含无规卷曲结构。敲除Pst DC3000 GK后,可降低菌体在基本培养基与丰富培养基中的生长速率,增加细胞中甘油含量,同时也使菌体在拟南芥叶片上的增殖能力降低。因此,Pst DC3000 GK基因参与调控菌体的生长过程,影响菌体甘油代谢。

湘西地区猕猴桃溃疡病病原菌分离及其全基因组分析

通过了解湘西地区猕猴桃溃疡病致病菌分类地位和基因类型,初步探讨其致病的分子机理。采用纯培养法分离猕猴桃溃疡病菌;基于16S~23S rRNA基因内转录间隔序列进行病原菌的系统发育分析;通过基因组测序和生物信息学分析解析其致病的分子机理。从“米良1号”和“红阳”猕猴桃感病枝条中分离获得5株溃疡病菌,编号为L211、L212、L321、L322、L323;通过形态特征和16S~23S rRNA基因内转录间隔序列分析,鉴定5株细菌均为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidae,Psa)。以菌株L211为代表进行体外猕猴桃枝条接种实验表明能引起典型溃疡病症状。通过菌株L211的全基因组测序和生物信息学分析,获得5741条基因数目,长5412072 bp;基因功能注释发现菌株L211携带121种毒力因子、71个植物互作因子和77个耐药基因;同时,基因组单核苷酸多态性分析发现病原菌L211为基因Ⅲ型Psa。引起湘西地区猕猴桃溃疡病的病原菌是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因Ⅲ型,与国内外报道的引起猕猴桃溃疡病大流行的致病菌一致。猕猴桃溃疡病发病原因可能是病原菌的多种毒力基因和互作基因协同作用的结果。