螺旋藻藻胆体核心复合物结构与功能的研究──四种变藻蓝蛋白复合物的分离及光谱特性的研究

从螺旋藻（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａｐｌａｔｅｎｓｉｓ）的藻胆体中分离出四种不同光谱形式的变藻蓝蛋白（ＡＰＣ）复合物：ＡＰⅠ、ＡＰⅡ、ＡＰⅢ、ＡＰＢ，利用吸收光谱、荧光先谱（室温和低温）以及荧光激发偏振光谱比较了ＡＰＣ复合物三聚体和单体的光谱特性。四种ＡＰＣ复合物三聚体的最大吸收和最大发射峰位置各不相同，ＡＰⅡ和ＡＰⅢ位于短波区（最大吸收波长在～６５０ｎｍ．最大发射波长在６６２～６６４ｎｍ），ＡＰⅠ和ＡＰＢ位于长波区（最大吸收波长在～６５５ｎｍ，最大发射波长在～６８０ｎｍ），低温下的荧光发射光谱均有红移。在能量传递中，各种不同形式的ＡＰＣ复合物表现出不同的功能，以实现能量的高效传递：ＡＰⅡ和ＡＰⅢ是能量传递的中介，ＡＰⅠ和ＡＰＢ作为终端发射基因，分别将激发能传给反应中心。通过荧光激发偏振光谱研究了四种ＡＰＣ复合物及其单体内各色团间的相互关系及其在能量传递中的取向和功能。

藻胆体核心复合物结构与功能的研究(Ⅱ)──4种变藻蓝蛋白复合物发色团相互作用机制

从螺旋藻藻胆体中分离出4种不同结构和光谱形式的变藻蓝蛋白复合物APⅠ、APⅡ、APⅢ和APB，利用吸收光谱、荧光光谱比较了三聚体和单体的光谱特性，通过对吸收光谱的光谱解曾以及各组分的归属，研究了变藻蓝蛋白复合物内各色团间相互作用的性质和在能量传递中的功能．结果表明，复合物内色团间的作用关系可以用Forster偶极-隅极作用机制来解释，由于连接蛋白和同源亚基的存在影响其结构的对称性，进而影响各色团间相互作用的形式和性质．

蓝藻(Cyanobacteria)藻胆体内核结构与功能的研究I.变藻蓝蛋白六聚体(αβ)5APβ16.3LCM42分离及其表征

利用藻胆体温和解离的方法和超速离心分离技术首次得到了变藻蓝蛋白六聚体，并通过光谱技术，凝胶柱过滤柱色谱方法，和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳方法以及蔗糖密度超速离心方法对其进行表征。结果表明：该变藻蓝蛋白六聚体的最大吸收峰（λＡｍａｘ＝６５２ｎｍ），荧光发射峰位于６６６ｎｍ，并且在６８０ｎｍ处有一明显肩峰；其分子量大约为２４０ＫＤ左右；其分子组成为（αβ）５ＡＰβ１６．３ＬＣＭ４２；离心沉降系数为１２Ｓ（０．２－０．５ｍｏｌ／Ｌ线性蔗糖密度梯度于０．０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液）。该六聚体在５ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ＝７．０）发生解离，通过羟基磷灰石柱分离可得到两种变藻蓝蛋白三聚体（αβ）３ＡＰ和（αβ）２ＡＰβ１６．３ＬＣＭ４２，这说明该变藻蓝蛋白六聚体是由两个变藻蓝蛋白三聚体组成；通过差谱的方法得出锚蛋白的吸收光谱（λｍａｘ＝６６０ｎｍ）；根据稳态光谱测定的结果，推断出锚蛋白碎片ＬＣＭ４２的光谱性质与整个锚蛋白的光谱性质相同，进而得出ＬＣＭ４２保留了整个锚蛋白中的发色团，因而保留了其传递能量的功能。

坛紫菜R-藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的亚基组成和发色团含量

坛紫菜(Porphyra haitanensis T.J.Chang et B.F.Zheng)中的R-藻蓝蛋白在Bio-Rex 70柱上用脲溶液(pH3.0)解离和层析,得到了α和β两个亚基,用SDS-PAGE测定α和β亚基的分子量分别为18 400和20 500。变藻蓝蛋白的α和β两亚基均分子量经测定,分别为18 800和19 700。R-藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白的分子量分别确定为117 000和112 000,两藻胆蛋白中α和β两个亚基的摩尔比都为1:1,确定两藻胆蛋白的亚基组成都为(αβ)_3。各亚基的发色团含量为:R-藻蓝蛋白中,α亚基含1个藻蓝胆素,β亚基含1个藻蓝胆素和1个藻红胆素。变藻蓝蛋白中,α和β亚基各含1个藻蓝胆素。

螺旋藻变藻蓝蛋白内能量传递机制的研究

利用ｐｓ时间分辨荧光光谱技术研究两种不同结构变藻蓝蛋白复合物ＡＰ６６５和ＡＰ６６０内能量传递过程，讨论了变藻蓝蛋白三聚体和单体内激发态作用机制。结果表明，ＡＰＣ单体只有一个短寿命（７５ｐｓ），来源于其两个亚基α８４／β８４间能量传递过程，另一长寿命（１０８０ｐｓ）是β８４基态恢复的平衡时间。两种ＡＰＣ三聚体均含有一个短寿命组分，从１６ｐｓ（ＡＰ６６０）到４８ｐｓ（ＡＰ６６５），它们来源于三聚体内互为Ｃ３对称单体内α８４／β８４间能量传递过程。ＡＰ６６０由于结构对称性低出现的短寿命组分（１０６ｐｓ），可指认为低对称单体的α８４／β８４之间能量传递时间常数。连接多肽对ＡＰＣ三聚体性质的影响明显地表现在其荧光衰减动力学过程中。

变藻蓝蛋白发色团之间激子相互作用

本文尝试性地建立了ＡＰＣ（αβ）３内内层部分具有Ｃ３群对称特性的三个β发色团之间的“三聚体”激子相互作用的模型，依据“三聚体”激子相互作用的光谱表征，通过对ＡＰＣ（αβ）３的吸收光谱和ＣＤ谱的解叠，分析和计算得到ＡＰＣ（αβ）３内β发色团之间的距离，以及在坐标中的相对位置，估算了激发能在三个激子态之间的去局域时间．

蓝藻(A.variabilis)藻胆体核结构与功能的研究II.变藻蓝蛋白六聚体内能量传递过程的物理机制

以变藻蓝蛋白的晶体结构和光谱性质为基础，利用密度矩阵理论对变藻蓝蛋白六聚体内的激发能传递物理机制进行分析，并利用时间分辨荧光光谱技术对其能量传递途径进行实时探测。结果表明：在变藻蓝蛋白六聚体内，色素对（毗邻单体上的色素αｉ８４βｊ８４，其中ｊ＝ｉ±１，和β＊ＬＣＭ４２）内的能量传递服从激子偶极－偶极相互作用机制；而色素对之间的能量传递机制则为Ｆｒｓｔｅｒ偶极－偶极相互作用机制，并且其能量传递途径分为两类：（１）．两个变藻蓝蛋白三聚体之间色素对的能量传递，其时间常数大约为１５ｐｓ左右；（２）．同一变藻蓝蛋白三聚体内色素对间的能量传递，在ＡＰＩＩ三聚体内，其能量传递时间大约为４５ｐｓ左右，而在ＡＰＩ三聚体内，其能量传递时间常数为４５ｐｓ和６５ｐｓ。

螺旋藻变藻蓝蛋白发色团间相互作用机理研究

本文发现从螺旋藻(Spirulina platensis)中分离出的变藻蓝蛋白三聚体(αβ)_3在解聚为单体(αβ)时,伴随着明显的光谱学特性的变化。我们利用稳态和皮秒(10^(12)S)瞬态光谱学的方法研究了导致变藻蓝蛋白单体(αβ)和三聚体(αβ)_3光谱学差别的发色团之间的相互作用。计算了变藻蓝蛋白中发色团的吸收和发射跃迁偶极矩之间的夹角。尝试性地建立了用以解释变藻蓝蛋白内发色团之间的相互作用的激子相互作用和弱偶极相互作用的机理模型。

变藻蓝蛋白内能量传递过程的物理机制——Ⅰ.单体内的能量传递机制研究的理论方法和实时探测

从广义主方程 (GME)理论出发 ,以变藻蓝蛋白的光谱性质和结构及其态的制备和探测技术为基础 ,从理论和实验上对变藻蓝蛋白单体内的能量传递过程的物理机制进行了比较详细的研究 .结果表明 :在变藻蓝蛋白单体内 ,2个亚基间的能量传递过程的最好探测技术为时间分辨各向异性光谱技术 ;实时探测结果 ( 80～ 10 0ps)与理论计算结果 ( 85 6ps)比较吻合 ,表明在变藻蓝蛋白单体内 ,能量在两个亚基间的传递过程服从F rster机制 ,能量传递过程不可能在其激发态的高振动量子态上发生 .

变藻蓝蛋白中能量传递过程的计算机模拟

藻胆体的变藻蓝蛋白 (allophycocyanin ,APC)核外联天线杆 ,内接光合反应中心 ,在能量传递中起着承上启下的作用 .根据X射线晶体结构数据和变藻蓝蛋白亚基的吸收和荧光光谱 ,以计算机模拟方法研究变藻蓝蛋白单体和三聚体中的能量传递过程 .计算结果表明 :变藻蓝蛋白单体中两个亚基之间能量传递性质与C 藻蓝蛋白 (C phycocyanin ,C PC)相似 ;而在三聚体时则与C 藻蓝蛋白三聚体有根本的区别 .无论什么聚集态 ,C 藻蓝蛋白中β84色团总是主要的荧光发射体 ;而在变藻蓝蛋白中α84则成为主要的荧光发射体 .这与C 藻蓝蛋白中能量传递的基本单元是六聚体而在变藻蓝蛋白中为三聚体的事实一致 .由此可以推断变藻蓝蛋白中 2个三聚体是以α84相接的面面接近方式 ,因而 2个三聚体间能量传递主要靠α84色团实现 .

条斑紫菜变藻蓝蛋白立方晶系的初步晶体学研究

蓝绿藻和绿藻中含有的藻胆体是光吸收和传递的功能单位,这些超分子聚集体位于线粒体膜的外表面,可吸收波长从450～650nm的可见光,其光能传递效率接近100%.电子光谱的研究表明藻胆体由核心和天线两部分组成,两部分均由藻胆蛋白和连接蛋白构成.核心部分主要为变藻蓝蛋白(allophycocyanin)所占有,其位于光合膜的外表面,靠近光系统Ⅱ,天线部分包括藻蓝蛋白(phycocyanin)和藻红蛋白(phycoerythrin),藻蓝蛋白靠近变藻蓝蛋白,而藻红蛋白处于天线的顶端.光能传递的途径为:光子→藻红蛋白→藻蓝蛋白→变藻蓝蛋白→光合反应中心的叶绿素a.到目前为止已有数种藻胆蛋白的晶体结构得到了测定.由于变藻蓝蛋白位于核心部位,直接将光能传递给光反应中心,其三维结构的研究一直受到人们的重视.1995年Breic等首次报道了取自单细胞蓝藻钝顶螺旋藻spirulina platensis的变藻蓝蛋白0.23nm分辨率的晶体结构.但红藻和蓝绿藻的出现相差16亿年。

红藻条斑紫菜变藻蓝蛋白晶体结构的分子置换法研究

以蓝藻钝顶螺旋藻（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）变藻蓝蛋白（ＡＰＣ－ＳＰ）的晶体结构为搜索模型，运用 ＡＭｏＲｅ程序，对红藻条斑紫菜（Ｐｏｒｐｈｙｒａ ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ）变藻蓝蛋白（ＡＰＣ－ＰＹ）的晶体结构进行了分子置换法研究．ＡＰＣ－ＰＹ晶体（晶型３）属Ｒ３２空间群，晶胞参数为ａ＝ｂ＝ １０．５３ ｎｍ， ｃ＝ １８．９４ ｎｍ， α＝β＝９０°，γ＝ １２０°．在单位晶胞的每个结晶学不对称单位中含一个αβ单体．在获得交叉函数解的基础上，进行了平移函数搜索，给出了Ｃ_ｃ值和Ｒ因子分别为６７％和３６．１％的最佳平移解．所得分子置换法的结果被用于ＡＰＣ－ＰＹ初始结构模型的构建和结构精化，经一系列 ２Ｆ_ｏ－Ｆ_ｃ ＯＭＩＴ图的综合验证分析，进一步证实了所得分子置换法解的正确性．

变藻蓝单体亚基的光谱特性,量子产率和荧光寿命

分离出具有荧光活性的变藻蓝蛋白的两种亚基α、β，这两种亚基的分子量分别为１７６００和１８０００。在高浓度的脲、β－巯基乙醇和低ｐＨ值（５．０）的条件下蛋白发生变性，没有荧光，复性后，最大吸收峰分别在６１０ｎｍ和６１６ｎｍ，荧光发射峰分别位于６４０ｎｍ和６４３．９ｎｍ。α亚基的荧光强度比β亚基的高得多，二者的荧光量子产率分别为０．６０和０．２６，荧光寿命相差的也很大，α亚基的荧光寿命为１．４ｎｓ而β亚基的为１．０ｎｓ，讨论了蛋白与发射团构象的作用关系及其对光谱学性质的影响。

藻胆体发射终端能量传递过程的研究

利用超快速时间分辨光谱研究了蓝绿藻藻胆体的２ 个变藻蓝发射终端（ＡＰＢ， ＡＰＩ）单体和三聚体内的能量传递过程， 探测到ＡＰＢ和ＡＰＩ单体的两组亚基αＡＰ／βＡＰ和αＡＰＢ／βＡＰ（αＡＰ／β１８）间的能量传递时间常数分别为３０ ｐｓ和１９４ ｐｓ． ＡＰＢ和ＡＰＩ三聚体所共有的９～３２ ｐｓ 的短寿命组分来源于同一单体内能量由αＡＰ向βＡＰ的传递过程． 另２ 个短寿命组分（６８ ｐｓ和５０ ｐｓ）则可分别指认为ＡＰＢ内βＡＰ→αＡＰＢ和ＡＰＩ内αＡＰ→β１８能量传递的时间常数， 所测得的长寿命组分则是几种终端基团基态恢复的平衡时间．

集胞藻ApcA和CpcA的体内生物重组研究

利用聚合酶链式反应(PCR)克隆出集胞藻Synechocystis sp.PCC 6803变藻蓝蛋白和藻蓝蛋白α亚基的编码基因apcA和cpcA,将脱辅基蛋白ApcA、CpcA分别与裂合酶CpeS1或CpcE/F以及血红素氧化酶HO1、胆绿素还原酶PcyA在大肠杆菌中共同表达。研究表明:通过大肠杆菌体内重组可以获得具有光学活性的重组色素蛋白PCB-ApcA和PCB-CpcA。吸收光谱、荧光光谱以及锌电泳均表明,藻蓝胆素与脱辅基蛋白形成了正确的共价连接。由此可知,利用大肠杆菌进行集胞藻藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白α亚基的体内生物合成是可实现的。同时还对重组色素蛋白的摩尔消光系数和荧光量子产率进行了计算。