餐饮食品中6病原菌叠氮丙啶-定量聚合酶链反应检测方法开发与检验数据分析

目的建立叠氮丙啶-定量聚合酶链反应法(propidiummonoazide-quantitativepolymerasechain reaction,PMA-qPCR)快速检测餐饮食品中6病原菌的方法。方法开发6种病原菌前增菌通用型培养基,采用热裂解方法提取样品DNA,采用PMA技术鉴别活菌与死菌,运用分子生物学技术检测样品中目标菌的特异性基因片段,建立病原菌的PMA-qPCR检测方法,开展餐饮食品样品病原菌筛查检测。结果本方法特异性良好,灵敏度较高, 1533份餐饮食品样品中检出病原菌71株,检出率为4.63%(71/1533)。结论本研究运用PMA-qPCR开展病原菌活菌检测技术研究,所建立研究方法可广泛应用于餐饮食品及相关食品中病原菌的快速筛查检测,具有较好的应用前景和现实意义。

叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌,构建病原菌分子进化树。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌5种病原菌作为研究对象,应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对与结果验证,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。结果 叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰,病原菌检出限可达到1×10^(3)CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在18 h内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,随机采集的751份冷链食品,共检出62株病原菌,病原菌总体检出率为8.3%(62/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建,成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。结论 本方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供新的思路与方法。

改良单叠氮丙啶-荧光定量PCR法的建立及其检测抗结核药物活性的价值

目的建立改良单叠氮丙啶(propidium monoazide xx,PMAxx)-荧光定量PCR(qPCR)鉴定MTB活菌和热灭活菌的方法,并探讨PMAxx-qPCR进行抗结核药物体外活性检测的价值。方法通过活菌和热灭活菌优化PMAxx针对MTB菌株H37Rv的预处理条件,包括曝光时间、暗孵育时间、PMAxx浓度,以及靶标DNA片段长度等。通过绘制量效曲线和建立循环阈值(Cq)与菌负荷的标准曲线,应用PMAxx-qPCR法计算测定异烟肼(INH)、利福平(RFP)的体外抗菌活性,评价检测敏感度,并分别与微孔板Alamar Blue(MABA)法和菌落形成单位(CFU)计数法进行比较,菌落计数采用独立样本t检验进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果当细菌负荷设定为107 CFU/ml时,在PMAxx浓度为10μmol/L、暗孵育10 min后曝光15 min可有效鉴别活菌、死菌(△Cq死-活=6.772±0.453),且使用>200 bp靶标片段可更有效地反映活菌、死菌的差异。PMAxx-qPCR方法在药物作用后3d可获得与MABA法一致性良好的最低抑菌浓度(MIC)检测结果(INH:0.049~0.076μg/ml与0.032~0.064μg/ml,t=0.782,P=0.491;RFP:0.102~0.145μg/ml与0.051~0.079μg/ml,t=2.828,P=0.066)。定量标准曲线Cq与菌计数(lgCFU/ml)呈良好的线性关系(R2=0.9863),最低检测限为102 CFU/ml,且PMAxx-qPCR方法和CFU计数方法测算16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的INH的抗菌计数分别为(4.376±0.344)和(4.325±0.318)、(4.232±0.106)和(3.936±0.194)、(4.122±0.277)和(3.874±0.105)、(3.950±0.113)和(3.675±0.250)、(3.770±0.228)和(3.618±0.257)CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.165、1.894、1.186、1.419和0.626,P值分别为0.880、0.199、0.357、0.292和0.595),而16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的RFP的抗菌计数分别为(4.577±0.216)和(4.675±0.250)、(4.445±0.054)和(4.374±0.675)、(3.627±0.173)和(3.154±0.076)、(1.946±0.359)和(2.159±0.083)、(1.552±0.423)和(0.960±0.202)CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.469、0.199、3.535、0.784、1.777,P值分别为0.671、0.855、0.071、0.490、0.174)。结论建立的PMAxx-qPCR方法稳定,可应用于一线抗结核药物INH和RFP的活性检测,敏感度高且快速准确。

改良单叠氮丙啶-荧光定量PCR法的建立及其检测抗结核药物活性的价值

目的建立改良的单叠氮丙啶(propidium monoazide x,PMAxx).荧光定量PCR(qPCR)鉴定MTB活菌和热灭活菌的方法,并探讨PMAxx-qPCR进行抗结核药物体外活性检测的价值。方法通过活菌和热灭活菌优化PMAxx针对MTB终点H37Rv的预先条件,包括曝光时间,暗孵育时间,PMAxx浓度,以及靶标DNA片段长度等。通过量效曲线和建立循环阈值(Cq)与菌负荷的标准曲线,应用PMAxx-qPCR法计算测定异烟肼(INH),利福平(RFP)的体外抗菌活性,评价检测敏感度,并分别与微孔板Alamar Blue(MABA)法和菌落形成单位(CFU)计数法进行比较,菌落计数采用独立样本t检验进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果当细菌负荷设定为10^(7)CFU/ml时,在PMAxx浓度为10μmol/L,暗孵育10 min后曝光15 min可有效鉴别活菌,死菌(ΔCq死-话=6.772±0.453),且使用>200bp靶标片段可更有效地反映活菌.死菌的差异。PMAxx-qPCR方法在药物作用后3d与MABA法--致性良好的最低抑菌浓度(MIC)检测结果(INH:0.049-0.076μg/ml与0.032-0.064μg/ml,t=0.782,P=0.491;RFP:0.10^(2)~0.145μg/ml与0.051~0.079μg/ml,t=2.828,P=0.066)。定量标准曲线Cq与菌计数(IgCFU1ml)星示良好的线性关系(R^(2)=0.9863),最低检测限为102 CFU/ml,且.PMAxx-qPCR方法和CFU计数方法测算16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的INH的抗菌计数分别为(4.376±0.344)和(4.325±0.318).(4.232±0.106)和(3.936±0.194).(4.122±0.277)和(3.874±0.105).(3.950±0.113)和(3.675±0.250).(3.770±0.228)和(3.618±0.257)CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.165、1.894、1.186、1.419和0.626,P值分别为0.880、0.199、0.357,0.292和0.595),而16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的RFP的抗菌计数分别为(4.577±0.216)和(4.675±0.250).(4.445±0.054)和(4.374±0.675).(3.627±0.173)和(3.154±0.076).(1.946±0.359)和(2.159土0.083).(1.552±0.423)和(0.960±0.202)CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.469,0.199,3.535,0.784、1.777.P值分别为0.671,0.855,0.071,0.490,0.174)。结论建立的PMAxx-qPCR方法稳定,可检测--线抗结核药物INH和RFP的活性检测,敏感度高且快速准确。

PMA-qPCR定量检测畜禽肉类中沙门菌活菌的研究

目的将叠氮溴化丙锭(PMA)与实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)相结合定量检测畜禽肉类中活的沙门菌。方法通过优化光反应时间、PMA浓度等PMA作用条件,建立PMA-q PCR方法,构建重组质粒建立标准曲线,考察该方法的灵敏性、特异性,并将该方法用于定量检测未经增菌培养的畜禽肉类样品中的沙门菌。结果在PMA浓度为15μg/m L、曝光5 min的条件下可完全抑制样品中死菌DNA的扩增。建立的定量标准曲线循环阈值(Ct值)与质粒标准品模板的拷贝数呈良好线性关系(r2=0.997 9),最低可检出10拷贝/反应体系。所建立的PMAq PCR方法最低可检出21拷贝/μL沙门菌。采用PMA-q PCR检测人工染菌鸡肉样品,最低可检出103CFU/m L沙门菌。结论用PMA-q PCR方法可实现定量检测畜禽肉类样品中活的沙门菌,从而达到快速检测的目的。

丙型肝炎病毒RNA与血清标志物的关系

目的 :探讨血清HCVRNA含量与丙氨酸氨基转氨酶 (ALT)、HCV抗体的关系。方法 :采用荧光定量 聚合酶链反应 (FQ PCR)检测 75例HCV抗体复检阳性无偿献血者、9例丙型肝炎患者的HCVRNA含量 ,并与HCV抗体、ALT的检测结果比较。结果 :75例献血者中 ,HCV抗体 (+ )、ALT(-)组HCVRNA阳性率高于HCV抗体 (+ )、ALT(-)组。在 9例丙型肝炎患者中 ,ALT与HCVRNA含量呈正相关 ,且相关性显著 (r =0 72 ,P <0 0 5 )。结论 :在HCV感染的人群中 ,ALT的高低可间接反应HCV在体内的状态 。

速冻面米制品中金黄色葡萄球菌和肠毒素A基因三重PMA-qPCR快检方法的建立

为建立准确定量速冻面米制品中金黄色葡萄球菌活菌,筛查肠毒素sea基因并指示PCR反应假阴性的三重PMA-qPCR检测方法。针对金黄色葡萄球菌特异靶基因RpiR和肠毒素基因sea序列保守区,设计引物、探针和构建扩增内标,优化建立三重qPCR检测体系,建立PMA食品前处理方法去除死菌DNA,构建纯培养物和速冻面米制品中污染金黄色葡萄球菌的定量标准曲线,应用三重PMA-qPCR方法检测人工污染金黄色葡萄球菌的速冻面米制品。采用GB4789.10-2016中规定的选择平板计数法,评价三重PMA-qPCR方法的检测性能。结果表明,三重PMA-qPCR检测体系扩增效率高,特异性好。当食品中金黄色葡萄球菌污染量大于10^3CFU/g时,靶基因RpiR可获得有效扩增,污染量在10^3~10^7CFU/g之间时,扩增曲线线性良好(R^2=0.994),PMA-qPCR定量结果与平板计数结果一致性较好。当sea阳性菌株污染量大于10^3CFU/g时,应用PMA-qPCR方法可有效评估食品污染肠毒素A的风险。综上所述,本研究建立的三重PMA-qPCR检测方法操作简便,可快速定量检测速冻面米制品中金黄色葡萄球菌,评估食品污染肠毒素A的风险。

活菌核酸微定量技术评价抗菌药物对胞内鲍曼不动杆菌感染的影响

目的建立测定细胞内活菌含量的活菌核酸微定量技术,考察临床常用抗菌药物对胞内鲍曼不动杆菌感染的影响。方法采用抗菌药物-病原菌-上皮细胞共培养模型,以改良叠氮溴化丙锭-实时荧光定量聚合酶链反应(PMAxx-qPCR)法测定不同种类和不同浓度的抗菌药物对鲍曼不动杆菌侵袭人支气管上皮(HBE)细胞形成胞内菌数量的影响;显微镜下观察0.1倍最低抑菌浓度(MIC)庆大霉素对绿色荧光蛋白融合鲍曼不动杆菌(AB-GFP)侵袭HBE细胞的影响。结果与对照组比较,经0.1倍、1倍、10倍MIC的阿奇霉素、左氧氟沙星、头孢哌酮舒巴坦、替加环素,以及10倍、1倍MIC的多西环素、庆大霉素干预的鲍曼不动杆菌侵袭HBE细胞形成胞内菌的数量均显著降低(P<0.001);经0.1倍MIC的庆大霉素干预的胞内鲍曼不动杆菌的数量均显著升高(P<0.001)。在0.1倍MIC的庆大霉素作用下,AB-GFP侵袭进入HBE细胞的量显著增加。结论0.1倍、1倍、10倍MIC的阿奇霉素、左氧氟沙星、头孢哌酮舒巴坦、替加环素、庆大霉素、多西环素均不能有效杀灭胞内菌。该方法操作简便、结果准确,能快速地测定胞内鲍曼不动杆菌的浓度,可用于评价抗菌药物对胞内鲍曼不动杆菌感染的影响,以及胞内鲍曼不动杆菌对抗菌药物的敏感性。

低浓度一氧化碳在防止大鼠小肠脂多糖诱导损伤中的保护作用

目的:观察低浓度一氧化碳(CO)吸入和腹腔给予在防止脂多糖(LPS)诱导大鼠小肠损伤中的作用,探讨其可能的信号转导机制.方法:6组SD大鼠ip 5 mg/kg体质量LPS或等容量生理盐水1 h后,对照组(A)吸入室内空气,CO组(B)吸入体积分数为2.5×10^(-4)CO,CO腹腔组(C)腹腔通入体积分数为2.5×10^(-4)CO,LPS组(D)吸入室内空气,LPS+CO组(E)吸入体积分数为2.5×10^(-4)CO,LPS+CO腹腔组(F)腹腔通入体积分数为2.5×10^(-4)CO.观察3 h放血处死,取小肠,酶联免疫吸附法测定血小板活化因子(PAF)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)水平:化学比色法测定丙二醛(MDA)含量及髓过氧化物酶(MPO)活性;流式细胞仪测定细胞凋亡率;半定量逆转录聚合酶链反应测定血红素氧合酶-1(HO-1)mRNA,蛋白印迹法测定磷酸化p38 MAPK表达;光镜观察形态学变化.结果:E和F组PAF、ICAM-1、MDA、MPO的表达(0.87±0.18 ng/g,0.82±0.16 ng/g vs 1.15±0.21 ng/g;2.96±0.39 ng/g,2.69±0.23 ng/g vs 3.48±0.36 ng/g;1.74±0.17 mmol/g,1.71±0.24 mmol/g vs 2.75±0.76 mmol/g;35.34±14.67μkat/g,33.01±12.84μkat/g vs 68.01±18.67μkat/g;P<0.05)以及细胞凋亡率均明显低于D组(30.56%±6.33%,34.45%±5.77%vs 41.52%±3.36%;P<0.05),而HO-1 mRNA及磷酸化p38 MAPK的表达显著高于D组(6.29±1.56,7.21±1.78 vs 3.97±1.16,14219±1724,13774±1886 vs 10227±1312;P<0.05),E和F组小肠损伤较D组减轻,组间比较,差异无统计学意义.结论:低浓度CO吸入和腹腔给予通过抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡及上调HO-1表达,在防止大鼠小肠避免LPS诱导损伤中的保护作用;p38 MAPK可能参与CO保护作用的信号转导.

叠氮溴化丙锭结合qPCR检测与区分活菌和死菌的研究进展

活菌的检测是病原菌检验的关键,目前快速、灵敏、特异和准确的检测方法,如定量聚合酶链反应(quantitative PCR,qPCR)是微生物检测领域关注的焦点之一。其中,基于核酸结合染料如以叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)预处理的定量聚合酶链反应(PMA-qPCR)已广泛应用于多种病原菌活菌的检测,但仍然存在一定的局限性。现就PMA-qPCR检测与区分活菌(living bacteria)和死菌(dead bacteria)的研究进展作一综述。

PMA-ddPCR法检测活的非可培养状态高产乙醇肺炎克雷伯菌

目的建立活的非可培养(VBNC)状态高产乙醇肺炎克雷伯菌的绝对定量方法。方法诱导高产乙醇肺炎克雷伯菌进入VBNC状态,评价乙醇产量。建立PMA-ddPCR方法通过单拷贝基因来计数高产乙醇肺炎克雷伯菌VBNC状态的活细胞基因拷贝数。进一步在VBNC状态粪便模拟中,评价ddPCR对低浓度样品检测的灵敏度和适应性。结果对高产乙醇肺炎克雷伯菌梯度稀释液进行定量时ddPCR的检测下限是qPCR的10倍。在低温、低营养状态,高产乙醇肺炎克雷伯菌第45天进入VBNC状态,通过PMA-ddPCR对VBNC状态细胞进行定量结果为(5.46±0.05)log10 DNA 拷贝数/ml。VBNC状态的乙醇产量为<2.2 mmol/L,复苏后恢复产乙醇能力。VBNC状态粪便模拟样品中ddPCR最低检测下限为3.2 log10 DNA拷贝数/ml。结论建立VBNC状态高产乙醇肺炎克雷伯菌的ddPCR检测方法灵敏度和适应性良好,可用于临床样品中VBNC状态细胞的检测。

粪肠球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立用于检测粪肠球菌的TaqMan实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法。方法根据粪肠球菌的d-丙氨酸聚连接酶(ddl)基因设计TaqMan FQ-PCR的引物及探针,并使用39种常见致病菌和条件致病菌检测其特异性。将目的基因克隆到质粒中,制作标准曲线,确定方法的检测下限。制备血液模拟标本,直接提取核酸进行检测,探索临床应用的可能。结果在特异性评价实验中,除阳性对照外其余样本均未出现特异性扩增曲线。建立粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法的标准曲线,确定该方法的检测下限为20 copy/管。通过对粪肠球菌血液模拟标本的检测发现,本方法对模拟标本的检测灵敏度为3.9×103cfu/ml。在稳定性评价中,对含菌量为3.9×108、3.9×106和3.9×104cfu/ml的血液模拟标本重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数(CV)为0.99%～1.84%。结论本研究建立了适用于临床标本检测的粪肠球菌TaqMan FQ-PCR方法。

人锌指蛋白23在原发性肝细胞肝癌中的表达及临床意义

目的 分析hZNF23在人HCC组织及HepG2细胞系中的表达情况,以探讨其与HCC临床病理特征和细胞凋亡的关系.方法 采用实时荧光定量RT-PCR法检测37例HCC患者（按Edmondson分为两组,Ⅰ＋Ⅱ级17例,Ⅲ＋Ⅳ级20例;按临床分为3组,HCC合并肝硬化和HBV感染组31例,HCC合并肝硬化和HCC合并HRV感染组各3例）癌组织和其癌旁肝组织标本中hZNF23及内参GAPDH mRNA的表达水平,并分析其与HCC临床病理特征的关系;体外培养HepG2细胞后,分为4组（对照组、1.25、2.5和5 μg/ml顺铂组）或6组（对照组、1.25、2.5、5、10和20μg/ml顺铂组）.采用四唑盐比色法（MTT）和流式细胞仪膜联蛋白V/碘化丙啶染色法检测与观察HepG2细胞的增殖及凋亡情况;实时荧光定量RT-PCR法检测HepG2细胞在不同浓度的顺铂诱导凋亡后,hZNF23及内参GAPDH mRNA的表达水平.结果 37例HCC患者癌组织及其癌旁组织标本中hZNF23相对表达量分别为8.84（3.59～15.05）和22.20（13.85～42.90）,差异有统计学意义（U=259.5,P＜0.01）.Edmondson Ⅰ＋Ⅱ级HCC组织hZNF23 mRNA相对表达量为12.80（4.80～19.50）,高于Ⅲ＋Ⅳ级的5.01（2.88～11.68）,且差异有统计学意义（U=99.00,P＜0.05）;合并肝硬化组为9.92（3.80～15.25）,未合并肝硬化组为3.21（2.78～3.60）、合并HBV感染组为9.09（3.72～15.25）,无HBV感染组为2.48（1.79～12.10）,合并肝硬化组与未合并肝硬化组、合并HBV感染组与未合并HBV感染组比较,其hZNF23 mRNA表达量差异均无统计学意义（U值分别为16.00和24.00,P均＞0.05）.顺铂作用于HepG2细胞24 h后,用MTT检测,顺铂明显抑制HepG2细胞增殖;膜联蛋白V/碘化丙啶染色法检测细胞凋亡率依次为（0.9±0.2）%、（4.2±0.3）%、（9.8±4.3）%、（23.0±6.0）%,顺铂显著诱导HepG2细胞凋亡,且呈剂量依赖性（F=27.890,P＜0.01）.实时荧光定量RT-PCR法检测1.25、2.5、5μg顺铂诱导的HepGR细胞组hZNF23 mRNA相对表达量依次为（10.39±3.08）×10-5、（24.10±2.09）×10-5、（6.90±2.24）×10-4,均显著高于对照组[（9.48±1.80）×10-5,F=6.027,P＜0.01].结论 HCC组织中hZNF23相对表达水平与Edmondson分级密切关联;顺铂对HepG2细胞的凋亡作用可能与hZNF23上调有关.