叠氮溴乙锭-环介导等温扩增法快速检测空肠弯曲菌活菌

目的建立叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测空肠弯曲菌活菌的方法。方法以空肠弯曲菌mapA基因为检测靶基因,纯培养物提取模板进行LAMP反应,检测空肠弯曲菌LAMP灵敏度、EMA曝光照射时间试验和使用浓度试验。结果空肠弯曲菌LAMP检测灵敏度为800 CFU/mL;曝光照射时间为5 min;EMA终浓度50μg/mL以下时不会抑制空肠弯曲菌活菌的DNA扩增,终浓度为1μg/mLEMA能有效抑制4×10~4CFU/mL空肠弯曲菌死菌扩增;1%活菌混合体系中EMA-LAMP检测结果为阳性。结论EMA-LAMP方法能有效快速检测空肠弯曲菌活菌。

食品中志贺活菌叠氮溴乙锭实时荧光聚合酶链反应技术研究

目的利用叠氮溴乙锭（ethidium monoazide bromide,EMA）实时荧光聚合酶链反应（PCR）技术,建立一种简便、快速、特异、灵敏的在食品中检测志贺活菌的方法。方法根据志贺菌ipa H基因保守序列设计特异性引物和探针。用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品EMA前处理条件。用已知菌验证志贺活菌检测的敏感性和志贺死菌检测的抑制性。用31株志贺菌、26株单增李斯特菌、24株沙门菌、25株副溶血弧菌、11株阪崎肠杆菌、10株致病性大肠埃希菌和1株大肠埃希菌验证方法的特异性和稳定性。同时用本研究方法和常规分离培养法,对30件模拟样品进行实样验证。结果志贺活菌EMA实时荧光PCR方法的循环阈值（Ct）=32.10~3.19×log（菌量）（R2=0.994）。最低检测浓度为2.20 CFU/反应。对死菌DNA抑制效率≥99.97%。31株志贺菌Ct值最低为15.04,最高为26.54,而97株非志贺菌的Ct值均〉35或无Ct值（呈一条直线）。重复试验Ct值变异系数〈3。30件模拟样品采用本研究方法和常规分离培养法的检测结果一致,但采用EMA实时荧光PCR方法耗时不超过7.5 h,而常规分离培养方法则需要3~5 d。结论 EMA实时荧光PCR技术是一种快速简便、特异性强、灵敏度高、仅检测志贺活菌的方法,建议在食品检测中推广应用。

脱氧胆酸钠在副溶血性弧菌死活细胞叠氮溴乙锭PCR鉴别中的应用

【目的】通过将表面活性剂脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate,SD)与叠氮溴乙锭(Ethidium bromide monoazide,EMA)-PCR反应体系相结合,建立SD-EMA-PCR鉴别副溶血性弧菌死活细胞的检测方法。【方法】依次对加入检测体系中的脱氧胆酸钠最适浓度、EMA区分死活细胞DNA的浓度范围、EMA激活光解最佳曝光时间进行优化;确定SD-EMA-PCR方法检测副溶血性弧菌死活细胞混合体系中活细胞的最低检出限。【结果】当脱氧胆酸钠浓度≤0.5 g/L,EMA的浓度为3.2?34.0 mg/L,曝光时间为25 min时,SD-EMA-PCR检测体系仅对死细胞DNA扩增产生抑制作用。SD-EMA-PCR检测活菌细胞的最低检出限为10 CFU/mL。【结论】死活细胞混合体系的SD-EMA-PCR检测证明该方法能够明显降低EMA-PCR漏检的死菌对检测结果造成的影响,为完善食源性致病菌检测中死活菌细胞鉴别方法提供了一种有效途径。

利用EMA-qPCR建立快速检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法

利用叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-qPCR),建立了一种有效快速检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法。以猕猴桃溃疡病菌ITS序列为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行qPCR特异性扩增。结果显示,qPCR检测灵敏度为2cfu;当EMA的浓度为2.0μg/mL时,能有效抑制1.0×10~7 cfu/mL经高温灭活的死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×10~1~1.0×10~5 cfu范围内,每个qPCR反应体系中活菌数与Ct值呈线性相关(R^2=0.988)。不同温度处理活菌菌悬液后用EMA-qPCR检测猕猴桃溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,结果表明待检样品可在4℃和20℃短期保存。对疑似带病猕猴桃材料进行EMA-qPCR检测,结果表明能减少猕猴桃溃疡病菌PCR的假阳性结果。本研究建立的EMAqPCR方法是一种有效检测猕猴桃溃疡病菌活菌的方法,能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。

EMA-qPCR方法快速检测番茄溃疡病菌活菌研究

将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-q PCR),建立一种有效快速检测番茄溃疡病活菌的方法。以番茄溃疡病菌Pat-1基因为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行q PCR特异性扩增。结果显示,q PCR检测灵敏度为1.0×101CFU/m L;当EMA的浓度为2.0μg/m L时,能有效抑制1.0×107CFU/m L灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×101~1.0×105CFU内,每个q PCR反应体系中活菌CFU数与Ct值呈线性相关(R2=0.987)。不同温度处理后EMA-q PCR检测番茄溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,表明待检样品可在4和20℃短期保存。对疑似带病番茄种子样品进行EMA-q PCR检测,发现EMA-q PCR方法能减少番茄溃疡病菌PCR检测的假阳性结果。本研究建立的EMA-q PCR方法是一种能有效检测番茄溃疡病活菌的方法,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。

金黄色葡萄球菌VBNC状态的诱导条件和EMA-qPCR检测

为建立金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)活的非可培养(VBNC)状态的诱导条件模型,考察了温度、盐度和酸度3个因素对金黄色葡萄球菌细菌可培养数的影响,通过正交试验优化得到了VBNC状态的诱导条件,同时观察细菌可培养数的变化,建立了DNA结合染料叠氮溴乙锭(EMA)与qPCR技术相结合检测VBNC金黄色葡萄球菌的方法.实验结果表明:细菌可培养数受酸度的影响最大,VBNC状态的最佳诱导条件为菌液在含15%NaCl和0.3%乙酸的营养肉汤培养基中于4℃下培养12 d;通过正交试验诱导后的不可培养菌可由EMA-qPCR方法有效检出,其与qPCR法的Ct值(荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数)之差在1.29～8.56之间变化.

肠炎沙门氏菌EMA-PCR检测方法的建立

将荧光染料叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术相结合,用于肠炎沙门氏菌活菌的检测。实验参数优化结果表明,当EMA终质量浓度50μg/mL、曝光时间10 min时,可以抑制约107 CFU/mL肠炎沙门氏菌死菌DNA的扩增;活菌灵敏度检测结果显示,EMA-PCR方法检测限与单一PCR方法一样均为27.5 CFU/mL,说明EMA处理既不会影响活菌DNA的扩增也不会影响PCR方法的灵敏度。利用EMA-PCR方法检测死活混合菌液时发现,添加EMA的实验组DNA条带亮度会随着活菌比例的降低而变暗,且当样品中全是死菌时,没有目标条带出现;而不添加EMA的对照组DNA条带亮度没有变化,当样品中全是死菌时,目标条带依然清晰可见。说明添加EMA可以达到区分死活菌的目的,EMA-PCR方法只检测样品中的活菌,避免了死菌DNA造成假阳性的可能性。

荧光染料EMA在实时荧光PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用

将荧光染料——叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时荧光-聚合酶链式反应(real-time poly-merase chain reaction,RT-PCR)技术相结合,对其在RT-PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用进行研究。纯培养条件下,在2.2×102～2.2×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且不添加EMA时的检测灵敏度(22CFU)略大于添加EMA(2.2×102CFU)时的检测灵敏度;人工污染牡蛎样品,利用RT-PCR和EMA RT-PCR以及平板计数法分别进行副溶血弧菌定量检测,结果表明EMA RT-PCR更接近于平板计数的结果,单纯RT-PCR定量的结果偏大;在采集的45份海产品样品中,不经富集培养,利用EMA RT-PCR方法仅有一份牡蛎样品呈阳性,牡蛎样品污染程度为114CFU/g。该方法能够快速、灵敏、准确地进行海产品中致病性副溶血弧菌活细胞的定量检测,具有很好的应用价值。

肠毒性大肠埃希菌肠毒素LTa基因特异性EMA-PCR检测方法的建立

由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,为避免因样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,本研究根据肠毒性大肠埃希菌(ETEC)不耐热肠毒素LTa基因设计特异性引物,利用叠氮溴乙锭(EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法。肠毒性大肠埃希菌CVCC196、CVCC197、CVCC200均能扩增出大小为438bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。经EMA处理,除了完全死菌组外,含有10mL/L～1 000mL/L活菌的混合悬液均可扩增出目的片段。因此,成功建立了一种快速、有效的检测肠毒性大肠埃希菌活菌肠毒素基因的EMA-PCR方法,该方法较传统PCR大大提高了检测的准确性,灵敏度可达19cfu/mL。

表面活性剂脱氧胆酸钠在单增李斯特菌死活细胞EMA-PCR鉴别中的应用

通过脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SD)结合染料叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与PCR反应体系相结合,建立纯培养条件下区分单增李斯特菌死活细胞的方法,即SD-EMA-PCR鉴别单增李斯特菌死活细胞检测法。结果表明:向浓度为2.0×108CFU/mL的单增李斯特死菌悬液中加入终浓度为1.5 mg/mL的表面活性剂脱氧胆酸钠后,EMA激活光解最佳曝光时间为25 min。SD-EMA-PCR检测体系中,对死菌细胞DNA的PCR扩增抑制的EMA最小浓度为1.6μg/mL;而对活菌细胞DNA的PCR扩增不抑制的EMA最大浓度为9μg/mL,活菌细胞的最低检出限为20 CFU/mL。SD-EMA-PCR检测法能够减小EMA-PCR漏检死菌细胞给检测结果带来假阳性的可能,降低了检测的成本,为单增李斯特菌的快速检测提供了一种新的有效途径。

EMA-PCR法快速检测啤酒中腐败短乳杆菌

将叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术相结合,以酒花耐受基因hor C为靶基因,用啤酒腐败短乳杆菌基因组DNA作为模板进行扩增。结果发现,在前处理过程中加入EMA,当终质量浓度小于20μg/m L时,对活的短乳杆菌中靶基因的扩增没有明显抑制作用;而当EMA终质量浓度为1.0μg/m L时可有效抑制10~5 CFU/m L短乳杆菌死细胞的扩增。本实验建立的EMA-PCR检测方法的灵敏度为10~4活细胞/m L酒液样品。验证实验结果表明,在13株乳酸菌中,建立的hor C特异性EMA-PCR能有效检测到其中的全部5株啤酒污染菌,同时可区分这5株菌的活/死细胞混合体系,降低检测过程中的假阳性。

发酵饲料中乳酸菌含量检测的EMA-qPCR方法

旨在快速检测发酵饲料中乳酸菌含量,将叠氮溴乙锭(EMA)与q-PCR技术相结合,通过对诸如EMA浓度、曝光时间等影响EMA的因素进行探索,确定EMA的作用条件。在试验条件下用EMA处理已知浓度的乳酸菌菌液,提取乳酸菌DNA,结合q-PCR建立Ct值与乳酸菌含量对数值之间的标准曲线。利用标准曲线,快速计算发酵饲料中的乳酸菌含量。结果表明EMA浓度在3~4μg·mL-1曝光10min可有效抑制死菌DNA的扩增,从而消除死菌DNA扩增对Ct值的影响。通过对8份发酵饲料进行检测,其结果与平板计数具有较高的符合度。EMA-qPCR方法可用于快速准确地检测发酵饲料中活的乳酸菌含量。

粪肠球菌活菌数EMA-qPCR快速检测方法的建立

利用叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide,EMA)和实时荧光定量PCR(qPCR)的结合,建立一种快速检测粪肠球菌(Enterococcus faecalis)活菌数的方法。选择粪肠球菌保守基因sodA(超氧化物歧化酶基因)作为目的基因进行qPCR方法建立;对粪肠球菌活菌和死菌进行不同浓度的EMA处理,探索最佳EMA处理浓度。结果显示,qPCR检测灵敏度为500 CFU/mL,在106~1010 CFU/mL浓度范围内,qPCR荧光信号值与活菌浓度对数值呈线性相关(R2=0.999 9),重复试验变异系数小于5%;EMA浓度为20μg/mL时,死菌的ΔCt值(加EMA-未加EMA)最大,且对活菌扩增无显著影响。试验结果表明,EMA-qPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可定向检测菌液中粪肠球菌活菌数,为粪肠球菌饲料添加剂等产品的质量控制提供技术支撑。

基于EMA-qPCR的茄科青枯菌活体检测技术的建立

【目的】利用特异性核酸染料叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合,建立一种能有效区分青枯菌死活细胞的检测方法。【方法】样品DNA制备前经EMA渗透预处理,再进行实时荧光定量PCR特异扩增菌体DNA。【结果】终浓度为2.0 mg/L的EMA能有效排除1.0×107CFU/mL灭活青枯菌细胞DNA的扩增,对活细胞和不可培养状态(Viable but non-culturable,VBNC)活菌的DNA扩增均没有影响。当每个定量PCR反应体系中的活细胞在5.0×100 5.0×104CFU范围内时,扩增Ct值与定量PCR反应体系中活细胞CFU对数值呈良好的负相关性(R2=0.992 5)。比较EMA-qPCR法和平板计数法对经过不同温度短期保存的青枯菌检测结果发现,待检样品可在24°C与4°C冷藏条件下短期保存。【结论】本研究建立的EMA-qPCR方法能有效检测青枯菌VBNC细胞和有效区分死活菌,避免或减少青枯菌PCR检测的假阳性和假阴性。

EMA RT-PCR法检测鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌活菌

目的:叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)具有特异性抑制死菌DNAPCR扩增而对活菌细胞无影响的特点,将其应用于鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌活菌检测。方法:待测样品中加入EMA至终质量浓度为50μg/m L,卤素灯曝光处理10 min,提取DNA进行RT-PCR反应,根据Ct值和标准曲线计算样品中活菌的数量。结果:相同细胞浓度条件下,活菌经EMA处理后其Ct值与未经EMA处理组的Ct值无显著性差异(P>0.05),且细胞浓度与Ct值均呈显著负相关性,相关系数分别是0.9916和0.9832;死菌经EMA处理后其Ct值与活菌经EMA处理后的Ct值有显著性差异(P﹤0.05),而与阴性对照组无显著性差异(P>0.05);死/活鼠伤寒沙门氏菌混合菌液污染鸡肉样品检测结果显示,与直接RT-PCR方法相比,EMART-PCR方法的检测结果更接近于平板计数结果。结论:EMA与RT-PCR相结合的方法可以快速、准确地检测鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌活菌的数量,避免假阳性结果,具有实用意义。