PMA⁃SRCA可视化检测海产品中的活副溶血性弧菌

为可视化检测海产品中的活副溶血性弧菌,该研究将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)染料与跨越式滚环等温扩增(saltatory rolling circle amplification,SRCA)技术相结合,以toxR为靶基因,设计并筛选引物,成功建立可视化PMA⁃SRCA检测方法,并评估所建立的方法。研究表明,12株副溶血性弧菌样品呈现阳性,29株非副溶血性弧菌样品呈现阴性,表明该方法特异性良好。该方法灵敏度为3.2×100 CFU/mL,高于可视化PMA⁃环介导等温扩增(3.2×101 CFU/mL)和可视化PMA⁃聚合酶链式反应(3.2×102 CFU/mL)的灵敏度。对76份市售海鲜样品进行检测,该方法的敏感性为100.00%,特异性为92.00%,符合率为97.37%。综上所述,可视化PMA⁃SRCA检测方法可检测活的副溶血性弧菌,具有良好的特异性、较优异的灵敏度。

叠氮溴化丙锭对食品中单增李斯特氏菌检测结果的影响

为研究叠氮溴化丙锭(PMA)在单增李斯特氏菌检测中的作用,利用实时荧光PCR方法检测不同浓度PMA处理的单增李斯特氏菌标准菌株CMCC 54004的死菌和活菌核酸的扩增情况。结果显示,1.0 mg/ml PMA能有效抑制单增李斯特氏菌死菌核酸的扩增。经过PMA处理后单增李斯特氏菌死菌与未经PMA处理的检测结果间差异极显著,而PMA处理后CMCC 54004活菌与未经PMA处理的检测结果间差异性不显著。通过对PMA处理的CMCC 54004死菌、活菌、不同比例死菌与活菌混合液以及其在不同食品基质下的检测结果的比较,进一步证实,1.0 mg/ml PMA在单增李斯特氏菌检测中能有效减少死菌核酸的影响,提高检测结果的可靠性。

基于叠氮溴化丙锭与恒温核酸扩增技术快速检测亚致死状态食源金黄色葡萄球菌

建立一种将荧光染料叠氮溴化丙锭（propidium monoazide,PMA）与环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术相结合的方法,用于快速高效检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。同时,采用人工污染金黄色葡萄球菌的速冻水饺和奶粉作为食品样品,研究PMA-LAMP方法的检测灵敏度。结果表明,PMA溶液质量浓度3μg/mL,650 W卤素灯下曝光5 min,PMA能够完全抑制1.2×10^7 copies/mL金黄色葡萄球菌死菌核酸扩增。PMA-LAMP方法能够在恒温65℃、60 min内完成对亚致死型金黄色葡萄球菌特异性nuc基因的特异性检测,其对亚致死状态金黄色葡萄球菌的检出限为34 CFU/mL,对食物样品速冻水饺和奶粉的检出限分别为17 CFU/m L和1.70×10^2 CFU/mL。建立的PMA-LAMP方法可以有效检测亚致死态金黄色葡萄球菌,提供了一种新的检测技术和解决方案。

基于叠氮溴化丙锭结合高通量测序技术分析口腔综合治疗台水路系统中活菌多样性的研究

目的:利用叠氮溴化丙锭(propidium monoazid,PMA)预处理方法结合高通量测序技术检测口腔综合治疗台水路系统(dental unit waterline,DUWL)中活菌微生物群落,以综合评估不同科室DUWL中的污染情况及探究活菌群落构成的多样性。方法:选择南京医科大学附属口腔医院33台口腔综合治疗台,牙体牙髓病科23台(E组),牙周病科10台(P组),在医院开诊前收集三用枪水样,PMA预处理水样后提取活菌总DNA,经细菌通用引物PCR扩增后构建宏基因组文库,用于高通量测序和生物信息学分析。结果:样本使用1μL PMA(最终浓度20μmol/L)预处理10 min后暴露于卤素光照射5 min,最适合检测DUWL样品中活菌的量;高通量测序显示DUWL中活菌微生物群落呈多样性,并具有潜在的细菌致病序列。科室间具有统计学差异的菌门为蓝藻菌门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、衣原体门(Chlamydiae)、Aerophobetes、绿弯菌门(Chloroflexi)、Bacteriadnorankk_unclassified、TM6(P <0.05);属水平上,军团菌属(Legionella)、Methyloversatilis、Obscuribacterales_norank差异有统计学意义(P <0.05)。结论:DUWL中致病微生物的存在对牙科医务工作者和患者都具有潜在感染风险,应重视DUWL细菌群落的多样性,有必要对DUWL进行定期水质控制。

基于PMA-LAMP技术可视化检测消毒产品消毒效果

探讨建立一种氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)染料与环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)联用的技术,实现可视化判断消毒产品消毒效果的目的。随机选取5种成分不同的市售消毒产品,回收消毒产品消毒处理后的菌液并进行PMA处理,并对处理后的菌液进行细菌基因组DNA提取。将大肠杆菌作为消毒效果检测的指示菌,针对大肠杆菌的fecA基因以及针对存在于所有细菌的16S rRNA基因进行LAMP扩增,并在反应体系中加入钙黄素染料。通过肉眼观察反应管颜色变化即可对消毒产品的消毒效果进行判断。将PMA-LAMP方法与PMA-qPCR方法进行比较后发现PMA-LAMP方法在操作步骤、检测时长、灵敏度方面均优于PMA-qPCR方法。在对消毒产品消毒效果的实际检测中,PMA-LAMP方法与《消毒技术规范(2002年版)》规定的标准方法的结果基本一致,两者杀灭对数值偏差在±0.5以内。该方法不依赖大型精密温控仪器,检测过程为45 min(不包括前处理步骤),实现了对消毒产品消毒效果现场快速可视化检测,具有良好的基层应用前景,将为消毒产品的性能评价提供参考、为行业市场监管提供技术支持。

叠氮溴化丙锭结合实时荧光定量PCR技术检测发酵乳中植物乳杆菌P-8活菌数

采用叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)结合实时荧光定量PCR对乳制品中活菌DNA进行定量分析,建立一种快速而准确检测发酵乳品中植物乳杆菌P-8(Lactobacillus plantarum P-8)活菌数的新方法。通过对影响PMA作用的浓度、暗孵育和曝光时间等因素进行试验,确定最佳PMA处理方案。结果表明:L. plantarum P-8经80℃处理60 s,即为膜损伤菌;当PMA质量浓度为40μg/m L,暗孵育时间10 min,曝光时间为20 min时,PMA既不影响活菌DNA的PCR扩增,又能渗透进入细胞膜受损的死菌并抑制其PCR扩增;通过制备L.plantarum P-8质粒标准品并建立标准曲线,其表现出良好的线性关系,相关系数(R2)为0. 992 9,最低检测限为103CFU/m L,特异性良好。该方法为完善发酵乳产品益生菌活菌数的检测奠定了基础。

叠氮溴化丙锭筛选环境活性微生物的原理及其应用

环境微生物总DNA主要来源于游离DNA以及活性和非活性微生物群。因此,单纯基于环境微生物总DNA的直接研究技术可能无法反映出环境中真实的活性微生物群落结构及组成,极易造成微生物丰度及群落多样性的高估,急需建立有效可行的活性微生物筛选方法。叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)是一种能够不可逆地共价结合死细胞DNA和胞外DNA(统称为relic DNA)的光敏性核酸染料,致使relic DNA被钝化,不能完成PCR扩增。基于此,结合后续荧光定量PCR和高通量测序等分子生物学技术,可快速、准确且高效地筛选区分出环境样本中的活性微生物类群。本文针对近几年关于PMA染料法在底泥、土壤和水体等常见环境样品中的应用研究结果进行综述,并探讨了目前PMA染料法应用中存在的问题,提出了相应的改进和完善对策,为深入研究复杂环境样品活性微生物类群及其结构功能提供了新思路。

叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR测定布鲁氏菌活菌数方法的建立

为简便、快速测定宿主体内或细胞内布鲁氏菌的活菌数,本研究以布鲁氏菌单拷贝bcsp31基因为检测靶标,设计特异性引物,经优化反应条件及叠氮溴化丙锭(PMA)最佳使用浓度与曝光时间,建立了一种测定布鲁氏菌活菌数的叠氮溴化丙锭--荧光定量PCR方法(PMA-qPCR),并评估了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,建立的qPCR标准曲线Ct值与质粒标准品拷贝数对数值之间线性关系良好;特异性试验结果显示,该方法对布鲁氏菌S2株扩增结果为阳性,对大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、副溶血弧菌扩增结果均为阴性;其对布鲁氏菌S2的检测限为10~3cfu/mL,比常规PCR方法敏感性高100倍;重复性试验结果显示,批间及批内重复试验的变异系数均为0.63%~2.04%,重复性好。利用该方法对不同比例布鲁氏菌S2活菌/死菌混合样品定量测定,结果显示随活菌比例的增大,测得的活菌数与常规qPCR测定值越接近,表明经优化处理的PMA有效抑制了qPCR对死菌DNA的扩增,但对活菌的qPCR扩增无影响。将该方法与平板计数法共同测定TSB纯培养的布鲁氏菌S2活菌数,结果二者的测定值无统计学差异。随后利用这两种方法同时测定两种不同浓度的S2侵染巨噬细胞后的胞内活菌数,结果显示两种方法测定值虽然均差异显著(p<0.05),但测得的活菌数均在一个数量级且变化趋势一致,并均与侵染的活菌数呈正相关。上述结果表明,本研究建立的PMA-qPCR检测方法可以对布鲁氏菌活菌实现快速定量检测,为布鲁氏菌活菌数测定相关研究提供可行技术。

叠氮溴化丙锭-qPCR法定量检测植物乳杆菌

目的将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)相结合,建立一种活性植物乳杆菌定量检测的PMA-qPCR方法。方法首先进行引物探针特异性验证,优化PMA反应条件,建立标准曲线,验证灵敏度,然后将该方法用于检测人工添加奶粉、米粉、酸奶样品以及冻干样品中的植物乳杆菌。结果最佳PMA浓度为2μg/mL,最佳曝光时间为10 min,建立的PMA-qPCR方法可以快速、高效、特异地检测植物乳杆菌,利用细菌纯培养物与对应Ct值建立标准曲线,可以看出纯培养物浓度与Ct值之间存在对应线性关系,相关系数(r^(2))为0.9992,最低检测限为15拷贝/反应体系,人工添加样品以及冻干样品检测中PMA-qPCR和平皿计数法结果的对数值进行配对t检验,显示在不同的人工添加样本以及冻干样品中均无显著性差异(P>0.05)。结论本研究建立的PMA-qPCR检测方法能快速、准确、特异、灵敏地定量检测活性植物乳杆菌。

叠氮溴化丙锭-羟基萘酚蓝-环介导等温扩增法检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌

将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)、羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术相结合,建立一种可视化PMA-HNB-LAMP方法快速检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)。结果表明,当PMA终质量浓度为5.0μg/mL、孵育和曝光时间均为15 min时,可有效抑制10~5 CFU/m L的单核细胞李斯特菌死菌DNA的聚合酶链式反应扩增,而对活菌DNA的扩增不具有抑制作用。LAMP反应体系中HNB终浓度为210μmol/L时,检测显色结果肉眼可见。该方法的纯菌液灵敏度为2.4×10~2 CFU/m L,人工污染肉制品的检出限为2.3×10~4 CFU/m L。分别采用国标法、PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法检测20份市售畜禽肉样,3种方法的单核细胞李斯特菌检出率分别为5%、10%和20%。PMA-HNB-LAMP法在一定程度上可解决LAMP法的假阳性问题,并且具有操作简单、可视性强的优点。

氮溴化丙锭与聚合酶链反应结合的细菌活细胞检测方法

目的:区分细菌PCR过程中的死活菌。方法:使用叠氮溴化丙锭(PMA)处理提取样品的基因,使样品中死细胞的DNA分子与PMA发生共价交联,使其DNA分子的PCR扩增被抑制。结果:当浊度<10 NTU时,对死细胞DNA的PCR扩增,PMA具备的抑制效用仍然有效;当浊度>100 NTU时,PMA的抑制效果就会失去。而当样品中的PMA质量浓度>3μg/ml时,曝光时间就会超过3 min,PMA可对死细胞DNA的PCR扩增进行抑制;PMA质量浓度>50μg/ml时,活细胞DNA的PCR扩增就会受到影响。结论:对异丙醇处理、热处理引起的细菌细胞膜破裂而产生的死细胞,可通过PMA与PCR结合的方法进行选择性地检测,能较好的区分死活菌。

PMA-LAMP法可视化检测乳中沙门氏菌

建立一种荧光染料叠氮溴化丙锭(PMA)与环介导等温扩增(LAMP)相结合的技术,同时利用羟基萘酚蓝(HNB)染料对婴儿配方奶粉中沙门氏菌活菌进行快速可视化检测。以沙门氏菌siiA基因为靶点,设计特异性引物,利用PMA抑制死菌DNA的扩增反应,反应前向体系中加入HNB染料,通过颜色变化对目标菌进行快速检测。结果表明,PMA的最佳处理浓度为3μg/mL,体系中HNB的最优浓度为150μmol/L,所构建的PMA-LAMP-HNB方法对沙门氏菌纯培养物的检测灵敏度为4.6×10^1CFU/mL,对人工污染婴儿配方奶粉中该菌的检测灵敏度为6.3×10^1CFU/g,是传统PCR方法的100倍,且总检测时间不超过1 h 30 min。

PMA-qPCR定量检测VBNC副溶血弧菌方法的建立与优化

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)在某些不利于生长的自然和食品加工条件下能够进入活的非可培养(viable but non-culturable,VBNC)状态,普通检测方式极易漏检,因此VBNC细菌检测技术的开发与优化对副溶血弧菌感染防控具有重要意义。基于叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR技术(propidium monoazide quantitative PCR,PMA-qPCR)能够利用活细胞的膜完整性区分活菌和死菌的原理,以副溶血弧菌ATCC 17802为对象,通过探讨PMA-qPCR方法中各项因素对活菌计数结果的影响,优化并建立了VBNC副溶血弧菌的定量检测方法。实验结果表明,当添加PMA质量浓度为15 mg/L,黑暗孵育10 min,再进行强光照射15 min后,死细胞的DNA扩增得到有效抑制,此时提取DNA模板进行qPCR扩增准确性更高,活菌数与qPCR扩增循环数呈现显著性线性相关(R^(2)=0.99)。PMA-qPCR法测定副溶血弧菌活菌数的标准曲线显示该方法检测范围为2.90×10^(1)~2.90×10^(8) CFU/mL,验证回收率在92.97%~99.57%,相对标准偏差为1.95%。该文建立了更加精准可靠的VBNC副溶血弧菌定量检测方法,为后续进一步探究提供了有效技术手段。

叠氮溴化丙锭(PMA)在食源性致病菌检测中的应用

食源性致病菌是危害食品安全和人类健康的主要因素,对食源性致病菌进行检测是控制食源性疾病的关键环节。传统检测技术无法检测活的非可培养状态(VBNC)的细菌。基于核酸的检测方法克服了这一缺陷,然而难以区分"死菌"与"活菌"。叠氮溴化丙锭(PMA)为一种对死菌核酸具有高度结合能力的光敏染料,近年来,将其与核酸检测技术相结合,广泛应于多种食源性致病菌的活菌检测。本文综述了PMA的作用机理,影响PMA活菌检测的因素以及PMA在常见食源性致病菌检测中的应用,并预期PMA的进一步应用与后续研究情况。

PMA-PCR诊断技术研究进展

叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)是一种光反应的DNA结合染料,具有极高的DNA亲和结合能力。PMA可进入死亡和外膜损伤严重的微生物内部,插入DNA结构中,经可见光刺激发生光裂解后,同DNA结合发生共价交联反应,共价交联产物可以抑制DNA的PCR扩增。基于PMA的这一特性,PMAPCR可用于鉴别活死细菌、真菌、病毒等微生物。在实际应用中,PMA-PCR检测结果受样本浊度、活死微生物比例、PMA浓度、暗处理条件(温度、暗处理时间)、曝光条件(光源、光处理时间)、样本处理方法以及目的基因扩增长度等多种因素影响。PMA-PCR已被应用于动植物疫病防控、食品安全、公共卫生等多个领域,具有广阔的应用前景。

基于PMA-qPCR方法检测兽用消毒剂对非洲猪瘟病毒的灭活效率

为评估规模化猪场生物安全防控水平,拟建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染性检测方法,并利用该方法检测兽用消毒剂对病毒的灭活效果。使用不同种类的消毒剂处理ASFV,通过PMA-qPCR评估消毒剂对ASFV的灭活效果和筛选消毒剂的最佳处理方式。PMA-qPCR结果显示,ASFV对不同类型的消毒剂表现出不同的敏感性,对过硫酸氢钾复合物溶液敏感性最高,该消毒剂按0.5%稀释,20 min内即可有效灭活ASFV。研究结果对生物安全的消毒环节具有一定的参考意义。

PMA-qPCR联用快速检测苹果中扩展青霉活菌

目的:为建立一种叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide,PMA)与实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction,qPCR)联用的快速检测扩展青霉活菌方法。方法:通过优化PMA处理浓度、黑暗孵育及曝光时间,筛选扩展青霉特异性引物,结合qPCR技术,建立一种基于PMA-qPCR联用快速检测扩展青霉活菌的方法,构建定量标准曲线,应用于人工污染的苹果样品中活菌的检测,与平板菌落计数比较评估该方法的可靠性。结果:PMA处理浓度10μg/mL、黑暗孵育5 min、曝光10 min为最佳PMA处理条件。4种引物中Pexp-patF对扩展青霉具有极强的特异性,可作为引物用于PMA-qPCR检测。构建的定量标准曲线的R2=0.9948,最低检测限为102.6 CFU/mL,方法检测结果与平板菌落计数无明显差异,并发现在苹果的未腐烂部分中可检测出扩展青霉活菌。结论:研究建立的PMA-qPCR技术可应用于苹果中扩展青霉活菌的检测,为扩展青霉精准防控提供一定技术支撑。

不同浓度叠氮溴化丙啶和照射协同灭活大肠杆菌8099 DNA效果评价

目的评价不同浓度叠氮溴化丙啶(PMA)在不同照射时间对大肠杆菌DNA灭活的效果,确定在实际使用中的最佳浓度和照射时间。方法选择相当于107cfu大肠杆菌(8099)的DNA作为灭活对象,加入终浓度为50μmol/ml、100μmol/ml、150μmol/ml和200μmol/ml的PMA,使用波长为460 nm的LED灯,分别照射5 min、10 min和15 min,然后进行Real Time PCR扩增。结果当PMA的浓度达到150μmol/ml,照射5 min时,大肠杆菌Real Time PCR扩增结果为阴性。结论在实际使用中,要完全灭活107cfu的大肠杆菌(8099)的DNA,需要≥150μmol/ml的PMA,照射时间≥5 min较合适。

PMA-qPCR方法快速检测细菌性果斑病菌活菌的研究

本文将叠氮溴化丙锭(PMA)与qPCR技术相结合,建立了一种适于细菌性果斑病菌株活细胞快速检测的PMA-qPCR方法。通过试验控制单因素变化,对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化,确立了PMA终浓度为9μg·mL^(-1),曝光时间为8 min的PMA预处理体系,能有效抑制1.0×10^(7)mL^(-1)灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在2.0×10^(1)~2.0×10^(6)mL^(-1),qPCR反应体系中活菌数与Ct值呈线性相关(R^(2)=0.9827)。本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范围内有效去除细菌性果斑病死菌的干扰,定量检测出活菌数量,研究结果可为植物细菌性果斑病的流行规律研究提供新的技术支撑,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。

PMA-qPCR方法快速检测活性E.coli O157:H7

建立将叠氮溴化丙锭(PMA)与定量PCR(qPCR)技术结合,用于检测热灭活菌背景条件下的大肠杆菌活菌的方法。结果表明:5min以上的强烈光照可以使PMA与DNA共价交联,同时完全钝化游离的PMA以避免"假阴性"结果;抑制死菌DNA扩增的最低PMA质量浓度为10μg/mL,不抑制活菌DNA扩增的最高PMA质量浓度为20μg/mL。当活菌/总菌大于1%时,经PMA预处理,可以消除热灭活菌DNA的干扰,实现对活菌的定量检测。