叠氮溴化乙锭与PCR技术结合检测活菌研究进展

微生物检验是食品安全把关的重要环节,而应用传统的培养法检测微生物难以做到及时、准确。PCR技术的出现为微生物快速检测开辟了新的途径,但该方法又难以区分食品中的死活菌。叠氮溴化乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术相结合,可以快速、准确检测食品中活体微生物,有效减少食品安全事件的发生。将对近年来EMA与PCR、RT-PCR和LAMP技术结合用于食品中活菌研究进展做一综述。

基于DNA染料EMA的RT-PCR技术定量检测海产品中病原性副溶血弧菌活细胞

将一种DNA染料叠氮溴化乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)技术相结合,建立一种能选择性定量检测牡蛎中trh阳性副溶血弧菌活细胞的新方法。结果表明:使EMA成功插入死细胞DNA并且光解溶液中游离EMA的最佳曝光时间为20min;不抑制副溶血弧菌活细胞DNA扩增的最大EMA质量浓度为2.0μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小EMA质量浓度为1.0μg/mL;人工污染牡蛎样品,不经过富集,在2.0×103～2.0×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且纯培养与人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测限均为2×103CFU,即人工污染牡蛎样品的RT-PCR检测灵敏度为每克牡蛎样品400个活细胞;冻融实验表明,在温度低于55℃的水浴中对冷冻海产品进行解冻时,冻融过程对副溶血弧菌活细胞几乎没有影响。该方法是一种快速、灵敏且能有效鉴别并定量检测病原活细胞的新方法。

EMA实时荧光PCR技术检测食品中单核增生李斯特活菌方法研究

目的利用叠氮溴化乙錠(EMA)实时荧光PCR技术,建立直接检测食品中单增李斯特活菌的方法。方法根据单核李斯特菌inlA基因设计特异性引物和探针。用不同EMA浓度、不同光照次数优化样品前处理条件。用平板计数法验证该方法的检出限及对死菌的抑制率。用35株单增李斯特菌、25株非单核李斯特菌、92株非李斯特菌验证该方法特异性。用添加了不同剂量的单增李斯特死菌、活菌及金黄色葡萄球菌的15件饮料,15件熟肉制品进行模拟实样检测。结果单增李斯特活菌EMA实时荧光PCR方法的Ct=(38.46-3.30)×log(菌量)(R2=0.999)。最低检测的活菌浓度为55cfu/反应。对死菌DNA抑制效率≥99.98%。35株单增李斯特菌Ct值最低16.21,最高29.38,而25株非单单增李斯特菌、92株非单增李斯特菌的Ct值均大于35或无Ct值。重复试验Ct值变异系数小于5%。30件模拟实样单增李斯特菌的检测结果与常规方法完全一致。且EMA实时荧光PCR方法检出时间仅需10h左右,而常规分离培养方法需要5~7d。结论 EMA实时荧光PCR检测技术是一种快速、简便、特异性强、灵敏度高、仅检测单增李斯特菌活菌的有效方法,可作为食品中检测单增李斯特活菌的方法推广使用。

EMA-LAMP方法快速检测食源性副溶血性弧菌活细胞

将一种DNA染料叠氮溴化乙锭(EMA)与环介导等温扩增技术(LAMP)相结合,建立一种能快速检测食品中食源性副溶血性弧菌活细胞的新方法。结果表明,EMA-LAMP方法最低检测限为1×10 CFU/mL,PCR方法最低检测限为1×103CFU/mL。与PCR方法相比较,EMA-LAMP检测方法具有快速、灵敏度高、操作简便等优点,并能检测鉴定副溶血性弧菌病原活细胞。

EMA-qPCR方法快速检测番茄溃疡病菌活菌研究

将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合(EMA-q PCR),建立一种有效快速检测番茄溃疡病活菌的方法。以番茄溃疡病菌Pat-1基因为检测靶标,菌体经EMA渗透处理,再进行q PCR特异性扩增。结果显示,q PCR检测灵敏度为1.0×101CFU/m L;当EMA的浓度为2.0μg/m L时,能有效抑制1.0×107CFU/m L灭活死菌的扩增,对活菌的扩增没有影响。当活菌数在1.0×101~1.0×105CFU内,每个q PCR反应体系中活菌CFU数与Ct值呈线性相关(R2=0.987)。不同温度处理后EMA-q PCR检测番茄溃疡病菌的存活情况并与平板计数法进行比较,表明待检样品可在4和20℃短期保存。对疑似带病番茄种子样品进行EMA-q PCR检测,发现EMA-q PCR方法能减少番茄溃疡病菌PCR检测的假阳性结果。本研究建立的EMA-q PCR方法是一种能有效检测番茄溃疡病活菌的方法,并能有效避免PCR检测实际样品可能造成的假阳性结果。

荧光染料EMA在实时荧光PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用

将荧光染料——叠氮溴乙锭(ethidium bromide monoazide,EMA)与实时荧光-聚合酶链式反应(real-time poly-merase chain reaction,RT-PCR)技术相结合,对其在RT-PCR定量检测海产品中致病性副溶血弧菌活细胞中的应用进行研究。纯培养条件下,在2.2×102～2.2×107CFU范围内细胞数的常用对数值与Ct值之间呈严格的负相关性,并且不添加EMA时的检测灵敏度(22CFU)略大于添加EMA(2.2×102CFU)时的检测灵敏度;人工污染牡蛎样品,利用RT-PCR和EMA RT-PCR以及平板计数法分别进行副溶血弧菌定量检测,结果表明EMA RT-PCR更接近于平板计数的结果,单纯RT-PCR定量的结果偏大;在采集的45份海产品样品中,不经富集培养,利用EMA RT-PCR方法仅有一份牡蛎样品呈阳性,牡蛎样品污染程度为114CFU/g。该方法能够快速、灵敏、准确地进行海产品中致病性副溶血弧菌活细胞的定量检测,具有很好的应用价值。

冷藏对虾中腐败希瓦氏菌活菌EMA-qPCR检测方法的建立

【目的】将叠氮溴乙锭(EMA)与实时荧光PCR技术相结合,建立快速检测腐败希瓦氏菌活菌的方法。【方法】用不同浓度的EMA和作用时间优化对腐败希瓦氏菌活菌的EMA-qPCR检测方法。研究该方法对活菌的最低检出限及能抑制死菌DNA扩增的最高浓度。研究该检测方法对不同比例死、活腐败希瓦氏菌的检测效果。用10株不同细菌验证该方法的特异性。检测101尾冷藏南美对虾中的腐败希瓦氏菌,并用平板培养法和qPCR方法对结果进行验证。【结果】EMA-qPCR检测最优方法为用终浓度20μg/mL的EMA处理细菌20 min。建立的EMA-qPCR法能够最低检测活菌的浓度为1 CFU/反应,能有效抑制1.0×10~7CFU/反应腐败希瓦氏菌死菌细胞DNA的扩增。对于死活混合菌,EMA-qPCR能够选择性扩增活菌DNA。该检测方法特异性良好。EMA-qPCR、平板培养和qPCR分别在16、12和19尾对虾中检测到腐败希瓦氏菌。【结论】EMA-qPCR检测技术能够快速、准确的区分腐败希瓦氏菌死菌和活菌,可作为水产品中腐败希瓦氏菌活菌的新检测方法。

EMA-qPCR检测空肠弯曲活菌方法研究

目的建立一种快速定量检测食品中“活的”空肠弯曲菌的技术方案。方法通过对103 CFU/m^10^6CFU/mL的空肠弯曲菌进行叠氮溴化乙锭(EMA)的前处理研究,建立区分死菌与活菌的EMA前处理技术,与荧光定量PCR检测弯曲菌的方法相结合,建立EMA-qPCR组合检测技术,并进行模拟食品标本的验证。结果空肠弯曲菌在103 CFU/mL^10^6CFU/mL内,EMA的最优使用浓度为5μg/mL,5μg/mL的EMA-qPCR可区分出死/活空肠弯曲菌混合物中的死菌和活菌,并成功应用于模拟食品标本中“活的”空肠弯曲菌的检测。结论EMA-qPCR可作为快速定量检测样本中“活的”空肠弯曲菌的方法。

双重PCR结合EMA检测副溶血性弧菌及携带trh相关毒性的活菌细胞

为建立一种有效鉴别副溶血性弧菌及trh相关毒性活菌细胞的方法,本研究针对副溶血性弧菌种属特异的tlh基因以及trh毒性基因设计引物进行双重PCR检测,采用双重PCR与DNA染料叠氮溴化乙锭(EMA)结合,在鉴定副溶血性弧菌活细胞的同时检测trh毒性。结果表明,该检测方法对海产品中的副溶血性弧菌及trh相关毒性活菌细胞的检测具有特异性,且灵敏度较高。在浓度为2.0×108CFU·m L-1,EMA浓度为1.0~8.0μg·m L-1的副溶血性弧菌悬液中,EMA激活光解20 min时,可抑制死菌细胞DNA的双重PCR扩增而不能抑制活菌细胞DNA的双重PCR扩增,从而实现副溶血性弧菌活细胞及trh基因相关毒性的鉴别。本研究建立的方法可以特异、高效的针对副溶血性弧菌及trh相关毒性活菌细胞进行检测,为食品检测提供了参考依据。

EMA结合实时荧光PCR方法检测单核细胞增生李斯特氏菌

建立叠氮溴化乙锭(EMA)结合实时荧光PCR(qPCR)方法检测单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)活菌。以李斯特溶血素O(LLO)基因hly设计引物、TaqMan探针,用李斯特属典型菌、沙门氏菌等56株致病菌株验证特异性,不同质量浓度EMA处理进行qPCR检测。尝试脱氧胆酸钠溶液(SD)强化抑制效果,73份不同的人工污染食品、环境样本(卤鸡肉、牛奶、肉馅、垃圾渗滤液)测试实用性。结果表明,引物探针准确检测L.monocytogenes,对其他菌株无特异性扩增。EMA最适质量浓度2.5μg/mL,经过15 min光激活与死菌DNA共价结合明显抑制了扩增,方法检出限为150 CFU/mL。SD处理L.monocytogenes活菌Ct值增加。与传统培养法比较,EMA-qPCR方法检测100%准确,操作简单、省时高效,在食品、环境方面应用前景广阔。

牛奶中活沙门氏菌BCAC-EMA-Rti-LAMP快速检测方法的研究

研究以沙门氏菌的invA基因序列设计特异性引物,结合蒙脱石封闭的活性炭(BCAC)吸附、叠氮溴化乙锭(EMA)前处理牛奶样品,建立了一种基于实时荧光环介导等温扩增法(Rti-LAMP)非预增菌快速检测牛奶中低浓度活沙门氏菌的方法。以每份25 mL牛奶样品,人工模拟不同浓度沙门氏菌污染,用4.0 g蒙脱石封闭的活性炭吸附处理样品,然后对回收精制的细菌样品用4.0μg/mL EMA终浓度作用处理,提取细菌样品DNA用于RtiLAMP扩增检测,该方法检测灵敏度为1×10^1CFU/mL活沙门氏菌,整个检测过程约5 h。以沙门氏菌国标检测法为参照,采用BCAC-EMA-Rti-LAMP检测生鲜牛奶样品27份,结果显示:2种方法均检测到同一份沙门氏菌阳性牛奶样品,而BCAC-EMA-Rti-LAMP另检测到3份牛奶样品沙门氏菌阳性。研究表明,建立的BCAC-EMARti-LAMP检测方法较国标检测法更灵敏、快速,可用于牛奶沙门氏菌污染的快速检测。

食品中蜡样芽孢杆菌芽孢EMA-qPCR检测

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是我国常见的食源性致病菌之一。基于PCR技术的快速检测方法在蜡样芽孢杆菌检测中已得到广泛运用,然而该菌在食品中多以芽孢形态存在,常规DNA提取方法难以得到高质量的DNA样本用于qPCR检测。本文对多种DNA提取方法进行比较,结果表明,超声波振荡法能够有效提取蜡样芽孢杆菌芽孢DNA。同时,对实时荧光PCR检测方法进行了改良,将DNA染料叠氮溴化乙锭(EMA)与PCR技术相结合,能够有效消除灭活菌株造成的假阳性结果,提高检测的准确性。

BCAC-EMA-Rti-LAMP非预增菌快速检测鱼肉污染活的副溶血弧菌研究

【目的】随着人民物质生活水平的不断提高,对食品质量要求也愈来愈高,食品安全现如今已经成为影响人类生命健康财产安全的重大公共卫生问题。食源性致病菌是引起食品安全中毒事件的主要原因,而副溶血弧菌主要污染海产品从而引起急性肠胃炎。因此,快速有效地检测筛查污染的海产品,是有效防控副溶血弧菌食源性疾病暴发的必要条件。【方法】研究以副溶血弧菌特异性tlh基因设计合成引物,以Midori Green为核酸荧光染料,构建了一种副溶血弧菌实时荧光环介导等温扩增(Rti-LAMP)检测技术,并联合蒙脱石封闭的活性炭(BCAC)、叠氮溴化乙锭(EMA)对样品前处理,建立了一种非预增菌快速检测鱼肉污染活的副溶血弧菌方法。【结果】Rti-LAMP检测纯培养副溶血弧菌灵敏度达1 CFU/反应,1 h以内完成。模拟污染1 g鱼肉样品,经4 g BCAC吸附和6μg/mL EMA终浓度处理细菌样品,提取细菌DNA用于Rti-LAMP扩增反应,最低检出限为6 CFU/g活的副溶血弧菌,整个检测过程需约5 h。对市售33份新鲜海鱼样品检测,BCAC-EMARti-LAMP检测出3份阳性样品,BCAC-Rti-LAMP为6份阳性样品,而相应国标检测法为2份阳性样品。【结论】研究表明,BCAC-EMA-Rti-LAMP可以有效检测区分样品中活的副溶血弧菌污染,较国标检测法更快速、灵敏,有望作为鱼肉副溶血弧菌污染的一种快速筛查检测方法。

食品中微生物检测新技术研究进展

食品微生物是影响食品安全的重要因素,由食源性致病菌引起的病例越来越多。但致病菌往往共存于复杂的生物体系中,且数量极少、致病性高,因此,微生物检测方法要有高灵敏度、特异性以及较短的分析时间,现有的成熟检测技术尚难以实现对微生物进行实时、准确、快速的检测,因而许多新的检测方法已成为研究的热点。从微生物检测的角度出发,对逆转录聚合酶链式反应、叠氮溴化乙锭聚合酶链式反应、可视化基因芯片、荧光标记噬菌体等近年来出现的新型检测技术进行论述,并分析各自的优缺点。

EMA-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的将叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)与PCR技术相结合,建立一种有效、快速检测活肠出血性大肠杆菌O157∶H7的方法。方法以rfbE为PCR检测靶基因,O157∶H7培养物经EMA处理后制备模板进行PCR检测,并对EMA使用浓度、作用时间等进行优化。结果不抑制O157∶H7活菌PCR扩增的最大EMA浓度为10μg/mL;抑制2×107 CFU/mL死菌PCR反应的最小EMA浓度为0.5μg/mL;该法对O157∶H7检测的灵敏度为2×104 CFU/mL,结果显示能检出混合体系中含有的1%的活菌。结论 EMA-PCR技术能有效检测活的O157∶H7,在突发公共卫生事件的快速检测中具有良好的应用前景。

EMA-PCR技术检测金黄色葡萄球菌活菌

目的将叠氮溴化乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)与聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)相结合,建立一种快速、有效检测金黄色葡萄球菌活菌的方法。方法用EMA处理金葡菌培养物后提取模板,以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶编码基因(nuc基因)为靶基因进行PCR反应,并对EMA浓度和曝光时间等条件进行优化。结果当检测2×106CFU/ml的金黄色葡萄球菌时,能有效抑制死菌DNA扩增的EMA最小浓度为0.3μg/ml,对活菌DNA扩增没有明显抑制的EMA最大浓度为2μg/ml;经EMA处理后,从含有1%金黄色葡萄球菌活菌混合悬液制备的DNA中可扩增出目的片段。结论 EMA-PCR能有效检测金黄色葡萄球菌活菌,在临床医学和公共卫生领域检测中具有重要的实用价值。

EMA-qPCR检测活沙门菌方法研究

目的为解决荧光定量PCR(qPCR)方法不能区分死菌和活菌的问题,探索一种快速定量检测“活的”沙门菌的技术路线。方法将不同浓度叠氮溴化乙锭(EMA)作用于不同浓度的死/活沙门菌后,用qPCR检测沙门菌Ct值,确定EMA的最优使用浓度。在混合菌量为106、105、104、103 CFU/mL,活菌比例为0%、10%、30%、50%、70%、100%条件下,确定EMA处理过的活菌+死菌,未加EMA的活菌+死菌,未加EMA的活菌+生理盐水三组菌的Ct值,研究EMA-qPCR法对死/活沙门菌的区分能力。结果EMA浓度低于50μg/mL,EMA处理活菌组与EMA未处理活菌组的Ct值差异无统计学意义。综合考虑,EMA最优使用浓度为10μg/mL。采用10μg/mL EMA进行预处理,混合菌量为106、105、104、103 CFU/mL时得出的结果一致:活菌比例为0%,≤50%,>50%时,EMA处理过的活菌+死菌与未加EMA的活菌+死菌两组Ct值差异(ΔCt)分别为≥5,≥1,<1。同时,除活菌比例0%外,其他活菌浓度下,EMA处理过的活菌+死菌与未加EMA的活菌+生理盐水两组Ct值无明显差异。结论菌量为103~106 CFU/mL时,通过10μg/mLEMA作用,EMA处理过样品与未加EMA处理样品的ΔCt值≥1,可考虑样品中沙门菌活菌比例≤50%。

沙门氏菌活菌实时PCR检测方法研究

建立一种叠氮溴化乙锭结合荧光PCR(Ethidium monoazide bromide real-time PCR,EMA-RT-PCR)快速检测沙门氏菌活菌的技术。以沙门氏菌f imY基因为靶点设计特异性引物,通过菌液浓度及叠氮溴化乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)相关反应条件的优化,建立沙门氏菌活菌的EMA-RT-PCR方法。经反应条件优化后,当EMA浓度为2.5μg/mL,暗反应5 min,曝光反应10 min条件下对10^(6)CFU/mL的沙门氏菌抑制效果最好,活菌的扩增没有影响,死菌的扩增受到抑制,所构建的沙门氏菌EMA-RT-PCR方法的检测灵敏度为2.5×10^(2)CFU/mL。用该方法检测8批次受沙门氏菌人工污染的阳性样品,结果显示该方法均能正常检出带活菌的样本,检测时间为4~5 h,比传统检测时间大大缩短。EMA-RT-PCR方法能准确区分活死菌,适合作为沙门氏菌的快速初筛方式。