国内甲型副伤寒沙门菌疫苗株的16S rRNA基因序列分析

目的对我国4株用于或拟用于疫苗生产的甲型副伤寒沙门菌的16S rRNA基因进行序列分析,考察其保守性和差异。方法提取4株菌基因组DNA,以16S rDNA通用引物进行PCR扩增,并对产物进行克隆及测序。结果4株菌均可扩增出约1500bp的目的基因片段,测序结果表明,4株菌中16S rDNA核苷酸序列一致性达99.77%。结论选择保守性高的16S rDNA区段进行序列测定,以防止种子批的变异,便于对疫苗生产用种子进行质量控制。

毒力岛基因SPI-1和SPI-2双缺失对肠炎沙门菌形态、毒力和免疫原性影响的研究

沙门菌毒力岛基因SPI-1和SPI-2分别编码Ⅲ型分泌系统(T3SS)中的T3SS-1和T3SS-2,T3SS可以将沙门菌分泌的效应蛋白转运至宿主细胞中。为分析毒力岛基因SPI-1和SPI-2缺失对肠炎沙门菌生物学特性、致病性和免疫原性的影响,本实验室前期构建了肠炎沙门菌SM6株毒力岛基因SPI-1和SPI-2双缺失株(SM6ΔT3SS),本研究通过绘制亲本株和缺失株的生长曲线,采用扫描电镜观察二者的形态,并测定二者对人结直肠腺癌细胞(Caco-2细胞)的黏附性与侵袭力。生长曲线结果显示,培养5 h时,SM6ΔT3SS株的生长速度显著快于亲本株SM6(P<0.05),自6 h起SM6ΔT3SS株的生长速度极显著快于SM6株(P<0.01)。扫描电镜观察可见,亲本株菌体多单个存在,而缺失株则出现明显的菌体聚集,且其表面被类似胶状物包裹。黏附性与侵袭力结果显示,与亲本株SM6相比,缺失株SM6ΔT3SS黏附及侵入Caco-2细胞的数量均极显著下降(P<0.001、P<0.001)。上述结果表明,毒力岛基因SPI-1和SPI-2的缺失可能改变了细菌的生长、代谢、分泌及或结构等特征,导致沙门菌的生物学特性的改变及降低了其对肠上皮细胞的黏附性和侵袭力。以1×10^(7)cfu/100μL的剂量经腹腔注射感染7日龄SPF鸡,并于感染后不同时间检测缺失株在SPF鸡盲肠、肝脏和脾脏的载菌量;将缺失株以1×10^(7)cfu/100μL的剂量经腹腔注射免疫7、21和35日龄鸡,在首免后不同时间采血,采用间接ELISA检测各组鸡血清中的IgG抗体水平;在首免后42 d时经腹腔注射1×10^(9)cfu/100μL/只的沙门菌SM6株,并于攻毒后7 d和14 d采血连同免疫期间采集的血一起采用间接ELISA检测各组鸡血清中IL-4和IFN-γ的分泌水平。在攻毒后14 d内观察并统计各组鸡的临床症状及死亡率。攻毒后7 d各组均剖杀部分鸡,采集其盲肠和肝脏组织制备病理切片观察各组织病理变化,评价该缺失株的免疫效力。载菌量结果显示,感染后2 d,缺失株在鸡脾脏和肝脏中的载菌量极显著低于亲本株(P<0.001),但在盲肠中的载菌量极显著高于亲本株(P<0.01);感染后4 d,缺失株在肝脏和盲肠中的载菌量极显著和显著低于亲本株(P<0.01、P<0.05);感染后8 d,缺失株在脾脏中的载菌量极显著低于亲本株(P<0.01),且两组鸡在上述脏器中的载菌量均降至较低水平;抗体和细胞因子的ELISA检测结果显示,首免后14 d,免疫组鸡的抗体水平显著高于对照组(P<0.05)。从免疫后21 d,免疫组鸡的抗体水平均极显著高于对照组鸡(P<0.001);免疫期血清中IFN-γ的分泌水平无明显变化,IL-4的含量在免疫后42 d极显著高于对照组(P<0.01);攻毒后鸡血清中IFN-γ和IL-4的含量均显著高于对照组(P<0.05)。整个实验期SM6ΔT3SS免疫组鸡均存活且无明显的临床症状、无死亡,肝脏和肠黏膜仅出现轻微病理损伤,对照组鸡组鸡攻毒后14 d内死亡率达80%,肝脏和肠黏膜均出显较明显的病变。上述结果表明,SM6ΔT3SS株能够刺激SPF鸡产生较高水平的体液免疫和细胞免疫反应,对SPF鸡的致病性降低,并对鸡有较好的免疫保护效力。本研究为阐明沙门菌致病机制和研发安全有效的沙门菌减毒活疫苗奠定了良好基础,也为沙门菌病的防控提供了新思路。

减毒沙门菌携带CWP2-S基因抗贾第虫口服疫苗的免疫原性

构建重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S,对其免疫效果进行检测。酶切连接法构建重组质粒p VAX1-CWP2-S,以电击转染的方式转入减毒沙门菌SL7207。体外连续培养检测重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S对质粒p VAX1-CWP2-S的携带稳定性;以重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1作为对照,经口服喂饲的方式免疫清洁级雌性BALB/c小鼠,8周后处死,检测各组试验鼠血清中和小肠灌洗液中特异性Ig G和SIg A的水平。结果是重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S连续培养168 h后,质粒携带率为90%;口服免疫小鼠8周后,与对照组相比,重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-CWP2-S免疫组血清特异性Ig G抗体增高约4.4倍,小肠灌洗液中特异性SIg A抗体增高约6.67倍。表明重组CWP2-S减毒沙门菌株具有良好的免疫原性。

沙门菌疫苗的应用现状及研究前景

沙门菌病(salmonellosis)是由沙门菌属(Salmonella)细菌感染引起的人畜共患病。接种疫苗是预防和控制畜禽沙门菌病的有效途径。由于当前使用的沙门菌减毒疫苗成本较高,免疫效果不稳定,免疫程序复杂,导致使用率不高。口服植物型沙门菌疫苗具有产量高、生产时间短、成本低、安全性高等特点。对口服植物型沙门菌疫苗的研究前景和研究方向进行综述,以期为该类疫苗的进一步研究开发和广泛利用提供参考。

口服甲型副伤寒沙门菌致病岛2缺失株对小鼠的免疫保护效力评估

目的评估甲型副伤寒沙门菌致病岛2缺失株(SPA017ΔSPI2)对小鼠的免疫保护效力,研制有效的甲型副伤寒沙门菌减毒口服疫苗。方法以1×10~8菌落形成单位(CFU)的SPA017ΔSPI2对6周龄的雌性Balb/c小鼠进行口服免疫,7 d后以相同剂量进行二次免疫,测定小鼠体质量变化、SPA017ΔSPI2体内定植水平、血清抗体水平和脾脏淋巴细胞增殖水平,并对SPA017ΔSPI2亲本株SPA017攻毒后的保护效力进行评价。结果 SPA017ΔSPI2免疫后不影响小鼠的生长性能,该缺失株在小鼠体内具有一定的定植能力,且SPA017ΔSPI2能够诱导小鼠产生显著的体液免疫应答和细胞免疫应答反应,攻毒后免疫组小鼠的发病率和死亡率均显著低于对照组。结论甲型副伤寒沙门菌致病岛2缺失株经口服免疫后可对小鼠提供良好的免疫保护,可以作为甲型副伤寒理想的疫苗候选株。

利用减毒沙门菌递送的柯萨奇病毒A16型VP1基因重组质粒的构建和鉴定

目的:构建能够稳定携带柯萨奇病毒A16型(CoxA16)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌并鉴定目的抗原的表达,研发利用减毒沙门菌递送的口服疫苗。方法:利用DNA重组技术,构建表达CoxA16 VP1蛋白的真核表达质粒,体外转染Vero细胞后检测VP1蛋白表达情况及抗原活性,并将该质粒通过电转化构建重组减毒伤寒沙门菌。结果:构建了表达CoxA16 VP1蛋白的重组质粒,转染vero细胞后检测到CoxA16 VP1蛋白的表达并具有抗原活性;获得能稳定携带该质粒的重组减毒伤寒沙门菌。结论:成功构建稳定携带柯萨奇病毒A16型(CoxA16)VP1基因的重组减毒伤寒沙门菌,为口服CoxA16疫苗的研究打下了基础。

甲型副伤寒沙门菌减毒株的构建与鉴定

目的构建甲型副伤寒沙门菌减毒株,测试其减毒效果,为制备减毒疫苗奠定基础。方法利用同源重组技术敲除甲型副伤寒沙门菌CMCC50093株的ync D基因和aro C基因,构建出ync D单基因敲除株和ync D-aro C双基因敲除菌株;通过测定和比较野生株、ync D单基因敲除株及ync D-aro C双基因敲除株的生长曲线,评估基因敲除对细菌生长的影响;以猪胃黏蛋白增毒小鼠为模型,测定野生株和双基因敲除株对模型动物的半数致死量LD50,评价双基因敲除株的减毒效果。结果成功构建并筛选到ync D单基因及ync D-aro C双基因敲除的甲型副伤寒沙门菌突变菌株。生长曲线测定显示ync D基因和aro C基因敲除后,敲除株生长明显缓慢。野生株和双基因敲除株针对模型小鼠的LD50分别为7.90×101和3.33×106CFU,结果表明ync D-aro C双敲除菌株的毒力较野生株下降约42 202倍,具有显著的减毒效果。结论本研究所构建的甲型副伤寒沙门菌ync D-aro C双基因敲除突变株毒力明显降低,安全性好,为研制甲型副伤寒减毒活疫苗奠定了坚实基础。

口服型VEGFR-2 DNA疫苗的研制及其对小鼠的免疫效应

目的:血管内皮生长因子受体-2(vascular endothelial factor recepto-2,VEGFR-2)在肿瘤生长和转移过程中起着重要作用,制备口服型VEGFR-2DNA疫苗并研究其生物免疫效应。方法:采用基因重组技术构建VEGFR-2胞外区基因表达载体pcDNA3.1-VR-2,DNA序列分析证实后,脂质体法转染COS-7细胞,Western blotting检测其VEGFR蛋白表达;以氯化钙法将pcDNA3.1-VR-2转化减毒沙门菌SL3261,制备口服型VEGFR-2DNA疫苗。口服型疫苗免疫C57BL/6小鼠,ELISA法检测免疫后小鼠外周血VEGFR-2抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞对小鼠血管内皮细胞的体外杀伤活性。结果:成功制备口服型VEGFR-2DNA疫苗。ELISA法检测显示,疫苗组小鼠抗体滴度随着免疫时间和免疫次数的增加而增高,在免疫6周后产生了高水平抗VEGFR-2IgG类抗体(1.07±0.018),明显高于生理盐水组(0.14±0.033)和质粒对照组(0.14±0.038),差异均有统计学意义(F=853.17,P=0.000)。MTT法检测显示,疫苗组小鼠脾淋巴细胞对靶细胞MS1的杀伤率随着效靶比的增加而增加,在效靶比8∶1时CTL活性(89.38±1.51)明显高于生理盐水组(15.17±2.54)和空质粒对照组(12.99±4.31),差异有统计学意义(F=315.42,P=0.000)。结论:成功制备了口服型VEGFR-2DNA疫苗,该疫苗可激活小鼠特异性的细胞免疫和体液免疫,为进一步抗肿瘤研究奠定了基础。

表达HCV核心蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门菌口服免疫小鼠的研究

构建了丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白原核表达质粒pQE-HCV,转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中,SDS-PAGE和Western blot检测到该重组菌能表达3种分子量的HCV核心蛋白,以该重组菌作为口服型活疫苗灌胃接种BALB/c小鼠,检测到小鼠产生的抗HCV核心蛋白IgG及迟发型超敏反应、T细胞增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞反应,结果表明该重组菌能有效诱导免疫应答,尤其能高效诱导细胞免疫应答,这为研制高效免疫、成本低廉、接种方便的HCV疫苗提供了一个新的可行途径。

猪圆环病毒2型ORF2基因重组植物乳杆菌的构建及其免疫原性分析

为研制一种能有效控制猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的新型疫苗,本试验将PCV2的ORF2基因克隆至植物乳杆菌表达载体pSCPSP超强启动子SCP的下游,构建重组表达质粒pSCPSP-Cap,用电击转化法转化克隆至表达宿主菌植物乳杆菌,获得一株重组植物乳杆菌。以SDS-PAGE和Western blotting法检测24h上清液中表达的蛋白;将8周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分组,每组8只,分别设置对照组、空载体组、灌胃组、饮水组、灭活疫苗组,试验14、28、42和56d后对小鼠采血,分离血清,利用PCV2ELISA抗体检测试剂盒检测小鼠血清中PCV2的抗体水平。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,PCV2衣壳蛋白在植物乳杆菌中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为28ku,且具有良好的反应原性,重组植物乳杆菌免疫小鼠诱导机体产生PCV2特异性抗体显著高于其他组(P<0.05)。结果表明,PCV2的ORF2基因在植物乳杆菌中成功表达,且具有良好的生物活性,可为PCV2口服疫苗的开发研究提供理论参考。

病原菌耐药信号传导机制及多抗原肽疫苗研究进展与发展趋势

细菌耐药性是当前人类面临的重大医学问题之一。接种疫苗是预防各种传染病最为经济和有效的措施,也是预防和控制耐药性病原菌感染相关传染病的有效途径。文中介绍了病原菌耐药相关信号传导机制及新型多抗原肽疫苗研究进展,并分析了其发展趋势,以供相关领域研究者参考。

减毒伤寒杆菌为载体的甲肝疫苗候选株的构建和免疫应答

目的 :构建以减毒鼠伤寒杆菌为载体的甲肝疫苗候选株 ,并证明其免疫源性。方法 :将甲型肝炎病毒编码区 c DNA插入高效表达质粒 p BV2 2 1。转化大肠杆菌 DH5 α。用核酸探针和限制性内切酶筛选和鉴定阳性克隆。将阳性重组质粒用电转移法转化减毒鼠伤寒杆菌 BRD5 0 9。用抗生素平板筛选法筛选出转化成功的伤寒杆菌 ,用温度诱导法诱导目的基因在伤寒杆菌中表达。结果 :蛋白质印迹法 (Western blotting)和酶联免疫吸附测定(EL ISA)检测表明 ,表达蛋白可与人抗甲型肝炎 Ig G发生特异性反应。用此伤寒杆菌口服或腹腔注射免疫小鼠 ,小鼠血清检测到抗甲型肝炎病毒的抗体。结论 :以减毒鼠伤寒杆菌为载体的甲肝疫苗构建成功 ,并可在体内外产生免疫应答。

植物乳杆菌RG-034对大鼠腹泻型肠易激综合征的治疗作用

目的研究植物乳杆菌RG-034的体外抑菌效果以及对大鼠腹泻型肠易激综合征的治疗作用。方法采用活菌计数法测定RG-034菌粉活菌数,利用类“牛津杯法”确定植物乳杆菌RG-034对大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的抑菌活性。SD大鼠按体质量随机分为对照组、模型组、蒙脱石散组及植物乳杆菌RG-034胶囊组,每组6只。除对照组外,其余大鼠每日ig5g/kg番泻叶联合隔日禁食,持续5周,制备大鼠腹泻型肠易激综合征模型。自造模第3周开始给药,植物乳杆菌RG-034组大鼠igRG-034胶囊(1×10^(9)CFU/粒,15mg),2粒/d;蒙脱石散组大鼠ig0.81g/kg蒙脱石散,1次/d;对照组和模型组大鼠ig等量生理盐水,给药3周。观察大鼠一般状态变化,测定稀便率、稀便级以及腹泻指数,采用16S核糖体RNA测序技术分析大鼠结肠中肠道菌群变化。结果植物乳杆菌RG-034菌粉活菌数为2.5×10^(11)CFU/g,对不同浓度的大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用,抑菌圈直径为15.90~25.06mm。与模型组比较,植物乳杆菌RG-034胶囊可明显改善大鼠腹泻情况,显著降低稀便率、稀便级以及腹泻指数,增加了肠道菌群多样性。结论植物乳杆菌RG-034对大鼠腹泻型肠易激综合征具有一定的治疗作用,其机制可能与调节肠道菌群多样性有关。

应用减毒沙门菌载体递呈多糖抗原的研究进展

近年来,应用减毒沙门菌载体递呈异源抗原开发口服活疫苗受到广泛的重视。沙门菌作为活的疫苗载体,其优点有:(1)沙门菌疫苗通过常规的细菌培养方法即可大量获得,而且可以通过食物或饮水口服给药,是大规模养殖场接种疫苗的经济、方便选择;(2)经口服接种的减毒沙门菌能够通过粘膜途径感染宿主,诱发特异性粘膜、体液和细胞免疫应答[1];(3)沙门菌可以在活细胞中生物合成多糖,并且这些多糖可以连接至类脂A(Lipid A)的核心寡糖部分,从而诱导针对异源多糖抗原的系统性免疫应答[2-3]。

伤寒甲型副伤寒结合疫苗的保护力研究

目的:研究伤寒甲型副伤寒结合疫苗在在动物身上产生的抗体抵挡伤寒和甲型副伤寒沙门菌的攻击情况。方法:用分别含2.5μg伤寒V i多糖和甲型副伤寒O多糖、伤寒甲型副伤寒结合疫苗免疫小鼠,免疫结束后9~11天分别用伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌进行攻击,观察小鼠存活情况,同时跟同剂量伤寒V i多糖和甲型副伤寒O多糖组进行比较。结果:伤寒甲型副伤寒结合疫苗在抵挡毒菌攻击方面比单纯的伤寒V i多糖/甲型副伤寒O多糖组表现了更好的保护力。结论:我公司研制的伤寒甲型副伤寒结合疫苗在小鼠身上产生的抗体在抵挡毒菌攻击方面表现了很好的保护力。

美国批准口服伤寒疫苗Ty21a

美国消息:食品和药物管理局(FDA)批准临床应用瑞士血清和疫苗研究所研制的口服伤寒活疫苗Ty21a。此疫苗是将伤寒沙门菌在营养基中培养后经干燥处理制成。瑞士研究人员对智利、埃及、印度尼西亚、瑞士和美国的50万以上成人和儿童进行了TyZ la临床试验。

猪霍乱沙门菌C500运载猪瘟病毒新型基因疫苗在家兔体内的免疫应答

为研究猪霍乱沙门菌C500(S.C500)运载猪瘟病毒(CSFV)新型基因疫苗口服免疫家兔的体内免疫应答特点,采用电转化法将CSFV新型基因疫苗转化到S.C500,构建重组工程菌,口服免疫接种家兔,检测CSFV、S.C500特异性抗体;并用猪瘟兔化弱毒疫苗及猪伤寒沙门菌野毒株依次进行攻毒试验。结果显示,成功构建CSFV新型基因疫苗重组菌S.C500/pCB-ME2-IL-15,S.C500/pCC-ME2-IL-15。口服免疫家兔可以诱导产生抗CSFV和S.C500的特异性ELISA抗体,且S.C500/pCC-ME2-IL-15略显优势。经三免后免疫家兔能够部分抵抗猪瘟兔化弱毒疫苗与猪伤寒沙门菌野毒株的攻击。试验提示以S.C500为CSFV新型基因疫苗运载体的猪用重组活菌苗具有可行性。