口腔上皮细胞具核梭杆菌表达与口腔鳞状细胞癌患者病情及预后的关系

目的探讨口腔上皮细胞具核梭杆菌预测口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者的预后价值。方法收集湖南中医药大学第二附属医院2018年12月至2022年4月151例OSCC的患者,实时定量荧光定量PCR对具核梭杆菌(Fn)基因序列进行定量。LPS和CD163免疫染色剂检测革兰氏阴性菌和巨噬细胞。评估肿瘤内Fn与两个独立的OSCC患者队列中的临床病理特征,复发和总生存期(OS)之间的关系,并探索与免疫相关基因的相互作用。结果Fn阳性与年龄较大、饮酒和饮酒加吸烟摄入较少以及淋巴结浸润频率较低有关;与Fn阴性肿瘤相比,转移性复发较少,OS、无复发和无转移生存期明显延长,免疫相关基因和免疫组织化学分析表明,Fn阳性与M2巨噬细胞呈负相关,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Fn相关性OSCC具有特定的免疫微环境,在老年非饮酒患者中更常见,并且预后良好。

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌刺激口腔上皮细胞白细胞介素-8的表达

目的比较不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）刺激下口腔上皮细胞白细胞介素-8（IL-8）的表达水平,初步探讨P.gingivalis致病性与其fimA基因型的关系。方法P.gingivalis ATCC 33277（Ⅰ型fimA）、W83、47A-1（Ⅳ型fimA）和KB细胞ATCC CCL-17共同孵育24h,以未受刺激的KB细胞作为对照组,分别在1、3、6、24h收集细胞和培养上清液。RT-PCR检测KB细胞IL-8m RNA的动态表达,酶联免疫反应检测培养上清液中IL-8的动态变化。结果2种fimA基因型菌株刺激1h,KB细胞IL-8mRNA的表达上调至峰值,高于对照组,3～24hIL-8m RNA的表达水平接近对照组;P.gingivalis感染细胞后3～24h,上清液中的IL-8水平低于对照组,Ⅳ型菌株低于Ⅰ型菌株;IL-8mRNA及其蛋白表达不完全一致,提示IL-8的表达存在转录后水平的调节。结论fimA基因型与口腔上皮细胞IL-8的表达水平相关,提示P.gingivalis致病性与其fimA基因型相关。

白色念珠菌对口腔上皮细胞细胞周期的影响

目的:研究白色念珠菌对口腔上皮细胞增殖及细胞周期的影响。从另一种角度证明白色念珠菌感染与癌发展的关系。方法:在培养的口腔上皮细胞(KB细胞)中,加入菌丝相、孢子相的白色念珠菌,共同培养48h,采用流式细胞仪观察白色念珠菌对KB细胞增殖及细胞周期的影响。结果:与对照组相比,菌丝组G0/G1期细胞所占比例降低,S期、G2/M期所占百分比显著升高,反映细胞增殖活力的增殖指数PI增高,差异有显著性(P<0.05)。而孢子组的KB细胞PI值与对照组相比无明显变化,P>0.05。结论:白色念珠菌可引起KB细胞细胞周期的改变;白色念珠菌对KB细胞周期的改变有赖于该菌的毒性及对细胞的感染。

白念珠菌感染口腔上皮细胞诱导炎症细胞因子的产生机制

目的探讨白念珠菌感染口腔上皮细胞诱导炎症细胞因子的产生机制。方法采用随机数字法将70只小鼠平均分为两组,每组包含35只受试小鼠,模型组建立小鼠口腔白念珠菌感染的体内模型,对照组不进行任何处理;感染5 d后比较两组受试小鼠菌落计数、炎症细胞因子表达水平以及TLR2、TLR4表达量。结果感染5 d后,模型组受试小鼠的菌落数以及白斑面积评分均明显高于对照组,两组间差异具有统计学意义(P<0.05);模型组受试小鼠血清TNF-α、IL-6水平明显高于对照组,TGF-β水平明显低于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05);模型组受试小鼠TLR2、TLR4 m RNA扩增带相对吸光度值明显高于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论白念珠菌感染口腔上皮细胞后炎症细胞因子表达水平增加,其机制可能与感染白念珠菌后,其菌体作用于TLRs进而引起细胞内信号转导相关。

HPV16 E6/E7对永生化口腔上皮细胞p53、p21表达的影响

目的:为了探讨人乳头状瘤病毒(HPV)转化口腔上皮细胞的作用机制,研究HPV16E6、E7对永生化口腔上皮细胞细胞周期调节因子p53、p21表达的影响。方法:免疫细胞化学法检测HPV16E6、E7诱导的永生化口腔上皮细胞HIOEC中野生型和突变型p53的表达;Western印迹检测HIOECHPV16E6、E7、p53、p21蛋白表达,并以正常口腔上皮细胞和转染空白载体的口腔上皮细胞为对照。结果:HIOEC细胞表达HPV16E6、E7蛋白,野生型p53和p21表达水平高于正常口腔上皮细胞和转染空白载体的口腔上皮细胞。结论:p53的失活可能不是HPV16E6、E7诱导口腔上皮细胞永生化的主要原因。

口腔上皮细胞感染白假丝酵母菌后HBD-2蛋白的表达

目的检测人β防御素2(Human beta defensin-2,HBD-2)在口腔上皮细胞中的表达以及白假丝酵母菌对其表达的影响。方法分别以孢子相、菌丝相以及灭活的白假丝酵母菌与KB细胞共同培养6、12、24h后,采用ELISA技术检测各组KB细胞培养液中HBD-2蛋白的表达情况,与对照组进行比较。结果 KB细胞有HBD-2蛋白的基础表达,感染6h后,各实验组与对照组之间表达差异无统计学意义(P>0.05);感染12h后,孢子组(93.974±6.426)、菌丝组(72.287±2.839)显著高于对照组(37.380±5.663),P<0.01;感染24h后,各实验组表达均高于对照组(P<0.05),但和12h时的表达相比,孢子组(80.851±7.860)、菌丝组(63.932±8.070)出现了下降趋势(P<0.05)。结论 HBD-2在口腔上皮细胞中有基础表达,白假丝酵母菌能诱导其表达上调;白假丝酵母菌对HBD-2的诱导表达只发生在感染的特定时期内,当菌丝进一步侵袭后,HBD-2的表达会逐渐减弱。

体外培养口腔上皮细胞感染白色念珠菌后白介素-8的表达改变

目的:观察白色念珠菌对体外培养口腔黏膜上皮细胞(KB细胞)表达白介素8(IL-8)的影响。方法:采用逆转录-聚合酶反应(RT-PCR)技术及酶联免疫吸附实验(ELISA),分别检测体外口腔上皮细胞感染菌丝型、孢子型、灭活白色念珠菌及白色念珠菌培养上清后表达、分泌IL-8的mRNA水平及上清液中的蛋白含量,对实验数据间差异进行t检验,判断分析其统计学意义。结果:菌丝型、孢子型及120℃灭活处理的白色念珠菌均能诱导KB细胞增强IL-8的表达,RT-PCR成像分析系统Mark值分别为180.23、186.36、143.41,与对照组85.57相比,具有显著性差异(P<0.05);白色念珠菌的培养上清(Mark值为80.87)却不能增加其表达。动态观察结果显示,白色念珠菌诱导KB细胞表达、分泌IL-8随时间增加而增强,72h达到高峰,随后出现下降趋势;剂量依赖性观察发现,KB细胞随着菌量增多而IL-8的分泌减少,呈现负相关性。结论:白色念珠菌能增加口腔上皮细胞分泌IL-8,IL-8可能与黏膜局部白色念珠菌感染、防御密切相关。

HPV16 E6/E7永生化口腔上皮细胞的上皮—间叶变

目的研究人乳头状瘤病毒HPV16E6/E7永生化口腔上皮细胞的上皮—间叶变(EMT),以及发生EMT细胞的生物学特征。方法相差显微镜、微分干涉显微镜观察HPV16E6/E7永生化口腔上皮细胞系HIOEC细胞形态学改变;透射电镜观察细胞间桥粒形成情况;RTPCR比较正常口腔上皮细胞和HIOEC细胞中βcatenin、上皮钙黏蛋白(Ecadherin)、wnt4、wnt5a、snail基因的转录情况;免疫组化检测HIOEC细胞中细胞角蛋白(CK)、波形蛋白(Vim)的表达。免疫荧光、激光共聚焦显微镜观察Actin细胞骨架的改变。结果HIOEC细胞呈梭形成纤维细胞样改变,细胞分散生长;RTPCR结果显示HIOEC细胞Ecadherin、wnt4转录水平下调,wnt5a转录水平上调,βcatenin、snail基因无明显改变。HIOEC细胞共表达CK和Vim。Actin细胞骨架在HIOEC细胞中更显丰富,呈束排列。结论HPV16E6/E7永生化口腔上皮HIOEC细胞发生上皮—间叶变,细胞表现间叶细胞的部分生物学特征。

体外共培养环境对犬脂肪干细胞、口腔上皮细胞的影响

目的:探讨体外共培养环境对犬脂肪干细胞(ADSC)、口腔上皮细胞(OK)移行速率、增殖速率的影响。方法:获取犬ADSC和OK并鉴定,将两种细胞种植于同一个刻度培养皿内,检测共培养环境下细胞的移行速率,与单一细胞培养环境作对比,观察细胞移行速率的改变。收集两种细胞培养上清,加入到对方培养基中,形成体外模拟混合培养环境,MTT法检测细胞增殖曲线的改变。结果:共培养环境下,OK、ADSC细胞的移行速率均较单一细胞培养环境下高。与常规培养相比,在体外模拟共培养环境下,OK、ADSC细胞的增殖曲线均变陡。结论:在体外共培养环境中,ADSC、OK呈现互相促进、互相吸引、协同增殖态势,细胞的移行速率、增殖速率均得到提高,能够共同用于组织工程口腔黏膜的构建。

HPV16E5、E6和E7基因重组慢病毒载体的构建及其感染口腔上皮细胞

目的分别构建HPV16 E5、E6和E7癌基因的重组慢病毒载体感染人口腔上皮细胞,为研究E5基因对口腔上皮细胞的致癌机制奠定基础。方法克隆HPV16 E5、E6和E7基因,分别构建p LVX-Ac GFP-E5、p LVX-Ac GFP-E6和p LVX-Ac GFP-E7重组慢病毒载体,与包装质粒共转染293T细胞。收集3种慢病毒上清液,分别感染口腔上皮细胞、腺嘌呤素筛选感染细胞,RT-PCR和Western blot法检测目的基因的表达。结果成功构建p LVX-Ac GFP-E5、p LVX-Ac GFPE6和p LVX-Ac GFP-E7重组慢病毒载体,获得3种慢病毒上清液,筛选得到3个稳定的细胞株。RT-PCR和Western blot均可检测到HPV16 E5、E6和E7基因在口腔上皮细胞内表达。结论本研究构建的3个重组慢病毒载体能成功感染口腔上皮细胞。

HPV16型E5基因对人永生化口腔上皮细胞E6、E7基因表达的影响

目的:研究HPV16型E5基因对人永生化口腔上皮细胞(human immortalized oral epithelial cell,HIOEC)E6、E7基因的影响。方法:HIOEC转染pLEGFP-E5基因反转录病毒载体,同时人为突变E5基因并转染HIOEC,通过PCR检测E5及各突变体在HIOEC中的表达。实时定量PCR检测E6、E7基因mRNA水平表达量的变化以及转染后HIOEC的细胞增殖能力,采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学处理。结果:构建了E5缺失突变体反转录病毒载体并成功转染人永生化口腔上皮细胞。转染后人永生化口腔上皮细胞的增殖行为实验表明,HPV16E5基因可促进人永生化口腔上皮细胞增殖(P<0.05),并对E6、E7基因mRNA表达具有正调控作用,但其缺失突变基因反转录病毒载体对人永生化口腔上皮细胞增殖及E6、E7表达无显著影响。结论:HPV16型E5基因可在一定程度上促进人永生化口腔上皮细胞增殖,并对E6、E7基因mRNA表达量有一定的间接上调作用。

单纯疱疹病毒Ⅰ型体外感染人口腔上皮细胞的实验研究

目的研究单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)体外感染人口腔上皮细胞的途径和方式。方法在体外利用非洲绿猴肾细胞大量扩增获得HSV-1,将此病毒体外感染人口腔上皮细胞,建立HSV-1体外感染人口腔上皮细胞模型,并收集HSV-1感染人口腔上皮细胞后的上清液转移感染Vero细胞。利用倒置显微镜对病毒感染进行形态学鉴定。应用聚合酶链式反应技术(PCR)对病毒核酸进行检测。结果倒置显微镜下人口腔上皮细胞未观察到典型的细胞病变,上清液转移感染后的Vero细胞发生典型细胞病变。利用PCR法可在单纯疱疹病毒Ⅰ型感染后的人口腔上皮细胞内检测到病毒核酸。结论HSV-1可直接感染人口腔上皮细胞。

牙龈卟啉单胞菌侵入口腔上皮细胞后基因表达变化的初步研究

目的:采用差异显示反转录PCR技术,比较牙龈卟啉单胞菌侵入口腔上皮细胞后基因表达的变化,初步筛选与细菌侵入宿主细胞相关的毒力致病基因。方法:提取纯培养状态和侵入KB细胞后的牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277细菌总RNA;反转录PCR技术显示cDNA表达条带;筛选并回收差异表达条带,二次扩增cDNA,经测序和BLAST同源性比对,初步分析细菌侵入KB细胞后表达差异基因的功能。结果:共筛选获得3条牙龈卟啉单胞菌侵入KB细胞后表达存在差异的基因HX 01、HX 02、HX 03;BLAST同源性比对结果显示,HX 01与牙龈卟啉单胞菌ABC转运蛋白编码基因PG 0683具有96%的同源性;HX 02与牙龈卟啉单胞菌PepO编码基因PG 0159具有97%的同源性;HX 03未找到类似同源性基因序列。结论:牙龈卟啉单胞菌在侵入KB细胞后发生了细菌毒力基因的表达变化,跨膜蛋白ABC转座子和PepO可能参与细菌侵入宿主细胞的致病过程。

激光显微捕获口腔上皮细胞的DNA分型

目的探索激光显微技术(lasercapturemicrodissectionsystem,LCM)捕获口腔上皮细胞,并进行STR-DNA分型检测的方法。方法用VERITAS显微切割仪红外低能激光显微捕获一定数量口腔上皮细胞,进行ProfilerPlus试剂盒STR复合扩增,检测DNA基因型。结果7～8个口腔上皮细胞能成功获得STR-DNA分型。3～4个口腔上皮细胞不能成功获得STR-DNA分型。结论激光显微捕获作为一种分离单个细胞的新技术,对于微量口腔上皮细胞的STR-DNA分型是可行的。

不同生物状态白色念珠菌对口腔上皮细胞的黏附能力及ALS mRNA表达

目的观察不同生物状态白色念珠菌对口腔上皮细胞的黏附能力及ALS m RNA表达,以期揭示口腔白色念球菌感染机制。方法将白色念珠菌3683、SC5314、3630与来源于50名健康志愿者的口腔上皮细胞混合培养,采用革兰阳性染色观察白色念珠菌的黏附能力,采用荧光定量RT-PCR法检测白色念珠菌3683、SC5314、3630中ALS2及ALS3 m RNA表达情况。采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析。结果黏附实验结果显示,3株白色念珠菌均可黏附于口腔上皮细胞,且菌株3683黏附数量明显多于菌株SC5314和菌株3630,统计学比较显示,差异有统计学意义(P<0.05),而菌株SC5314和菌株3630黏附数量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。荧光定量RT-PCR结果显示,白色念珠菌3683、SC5314、3630中均能检测到ALS2及ALS3 m RNA表达,其中,菌株3683ALS2及ALS3 m RNA表达水平均高于菌株SC5314和菌株3630,统计学比较显示,差异有统计学意义(P<0.05);菌株3630 ALS2及ALS3 m RNA表达水平均高于菌株SC5314,但两者比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论不同生物状态白色念珠菌的口腔上皮细胞黏附能力不同,菌株黏附能力的强弱可能与其ALS2及ALS3基因情况表达相关。

人口腔上皮细胞骨架观察实验的建立

细胞骨架是真核生物细胞的重要结构,研究细胞骨架的形态对进一步研究其功能具有重要意义。以建立一种在光学显微镜下观察到清晰的人口腔上皮细胞的细胞骨架的实验方法为目的,从实验材料的预处理、抽提时间、固定时间三个方面对现有的实验方法进行了改进和优化。结果表明,以人口腔上皮细胞为实验材料,取材后置于1 mol/L的甘露糖中预处理5 min,使用1%Triton X-100作为抽提试剂抽提25 min,使用3%戊二醛作为固定液固定20 min,最后只需使用考马斯亮蓝R250染色10 min便能够观察到清晰的细胞骨架结构。

利用口腔上皮细胞粗提取DNA的简单方法

利用人的口腔上皮细胞多次粗提取DNA，得到了操作简单、快速提取自己DNA的方法。该方法可以调动学生的积极性，与以往教学中常用的两种方法相比，效果更明显。

精神发育迟滞者和正常人口腔上皮细胞微核出现率的观察

对精神发育迟滞者和正常人口腔上皮细胞微核出现率进行了观察。结果表明：精神发育迟滞者微核出现率（４．６５‰）明显高于正常对照组（２．２０‰），Ｐ＜０．００１。提示口腔上皮细胞微核检测与淋巴细胞一样，可反映人体遗传物质的损伤。研究显示部分精神发育迟滞者可能是遗传物质受损所致。