盐析法快速提取口腔拭子DNA

目的建立盐析法快速从口腔拭子中提取基因组DNA的方法。方法首先以细胞裂解液和蛋白酶K消化口腔上皮细胞,然后用5 mol/L NaCl沉淀蛋白质,用异丙醇沉淀DNA,最后用70%乙醇洗涤得到的DNA并将其溶于TE(10mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)中。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对TP53基因的rs1042522和CHRNA3基因的rs12910984位点进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果单支口腔拭子提取得到的DNA量在0.68～2.56μg之间,D260/D280比值在1.77～1.94之间。经PCR扩增和酶切消化,10个样本的两个单核苷酸多态性都得到了清楚分型。酶切结果与测序结果吻合。结论本实验所建立的盐析法可以快速、简便、经济地从口腔拭子得到高质量的基因组DNA。

碱裂解法快速提取口腔拭子DNA对CHRNA3基因多态性的研究

目的建立一种快速的从口腔拭子中提取DNA的方法,研究其在尼古丁乙酰胆碱受体α3(CHRNA3)基因多态性分析中的应用。方法以NaOH和乙二胺四乙酸(EDTA)配制碱裂解液,以三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE)为中和液,经加热裂解和中和两步提取口腔拭子DNA。以提取的DNA为模板,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析对CHRNA3基因的rs6495309进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果 PCR扩增和酶切的靶带清晰,无非特异性条带。酶切结果与测序结果吻合。结论碱裂解法提取口腔拭子DNA具有快速、简便、经济、可靠的特点,可以用于CHRNA3基因多态性的分析。

口腔拭子DNA检验的实时定量研究

目的寻求提高口腔拭子的DNA检验效率的方法。方法对来源于不同个体或同一个体不同擦拭次数的口腔拭子用Chelex-100或磁珠法提取的DNA用实时定量PCR技术进行定量,同时用Identifiler复合扩增系统在ABI3100遗传分析仪上对这些DNA样品进行STR分型。结果在建立的Identifiler系统8μl扩增体系中,3个月内的口腔拭子用Chelex-100法提取的DNA模板1μl量较3μl量扩增效果好,磁珠法提取的DNA模板用量大小对复合扩增检测影响较小。结论用棉签擦拭颊粘膜5次制备口腔拭子,取其头部的约1/4用200μlChelex-100法提取DNA,然后用1μl模板进行复合扩增,是提高口腔拭子的DNA检验效率的简便可行的方法,但陈旧口腔拭子用磁珠法提取更能保证复合扩增分型成功。

一种从口腔拭子中提取DNA的简易方法

目的应用简便方法提取口腔拭子中DNA,并用特异引物扩增,评估该方法的应用价值。方法用1×PCR缓冲液、MgCl2及蛋白酶K混合裂解液在PCR仪上对口腔拭子进行消化,并以该产物为模板,应用角蛋白5基因1号外显子及1号染色体上2个微卫星标记特异性引物扩增,目的片段分别用于测序和毛细管电泳。结果通过上述方法可获得用于PCR反应及后续基因测序及微卫星标记毛细管电泳分型的足量DNA。结论利用PCR缓冲液、MgCl2及蛋白酶K混合裂解液从口腔拭子中提取DNA是一种简单、高效、快速、低成本的方法,更是一种无创的采样方法。

口腔拭子在药物性耳聋基因检测中的应用

目的:探讨口腔黏膜上皮细胞基因组DNA在药物性耳聋基因A1555G及C1494T突变检测中的应用,寻求基因检测中更简单快捷并无损的样本来源。方法:采集97例来自温州特殊教育学校非综合征型耳聋学生的口腔拭子和外周血,分别提取基因组DNA,进行浓度与纯度的测定、基因扩增及产物测序,比较2种样本来源及2种方法提取的基因组DNA的浓度、纯度、扩增成功率,并将测序结果与人类线粒体DNA剑桥参考序列进行比对。结果:口腔拭子DNA的手工法提取浓度(42.5±41.7)ng/mL与试剂盒法DNA浓度(44.8±43.4)ng/mL差异无统计学意义(P>0.05);手工法DNA纯度(1.45±0.73)低于试剂盒法(1.87±0.87),两组间差异有统计学意义(P<0.05);二者扩增成功率与外周血差异均无统计学意义(P>0.05);口腔拭子DNA的药物性耳聋基因扩增产物长短一致,测序结果完全相符,均显示A1555G突变阳性2例,阴性95例;C1494T突变97例均阴性。结论:无损性样本口腔拭子扩增成功率高,诊断结果可靠,可替代外周血作为药物性耳聋基因检测的DNA来源,具有一定的临床应用价值。

口腔鳞癌组织和口腔拭子中Dickkopf-1基因甲基化状态与疾病进展的相关性研究

目的研究口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织和口腔拭子(OS)中Dickkopf-1(DKK-1)基因甲基化状态与疾病进展的关系及其临床意义。方法选取诊断为OSCC的67例患者作为OSCC组,收集病变同侧和对侧OS标本及手术组织标本。另选择30例阻生智齿患者的健康口腔黏膜组织作为健康对照组,30例口腔黏膜下纤维病变(OSF)患者作为癌前病变组。采用免疫组化法检测组织DKK-1蛋白表达;采用重亚硫酸盐转化和定量甲基化特异性聚合酶链反应(qMSP)法检测DKK-1基因甲基化水平。结果癌前病变组(66.67%,20/30)和OSCC组(20.90%,14/67)DKK-1蛋白阳性表达率低于健康对照组(93.33%,28/30),且OSCC组低于癌前病变组,差异有统计学意义(P<0.001)。OSCC组肿瘤组织和OS标本中DKK-1基因甲基化水平高于癌前病变组和健康对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。Spearman相关系数分析显示,组织标本与OS病变同侧标本中DKK-1基因甲基化水平呈正相关性(r_(s)=0.672,P<0.001)。组织和OS病变同侧标本中DKK-1基因甲基化水平用于鉴别诊断OSCC和癌前病变的曲线下面积(AUC)分别为0.799(95%CI:0.713~0.884)、0.843(95%CI:0.762~0.924)。OS样本中DKK-1甲基化在早期(Z=2.354,P=0.021)和高分化肿瘤患者中更显著(Z=3.731,P<0.001)。结论从病变部位采集的OS标本中DKK-1基因高甲基化可用于OSF癌变监测以及OSCC的早期诊断。

一种新型口腔拭子在法医学上的应用

一种采集人体口腔颊粘膜细胞的新型口腔拭子，适用于法医DNA的样本提取，该拭子具有无损伤、无痛苦、操作简便成本低廉的特点。

3种常见PCR扩增试剂盒对陈旧口腔拭子检验效率比较

目的比较GlobalFiler、PowerPlex 21及Identifiler Plus3种PCR扩增试剂盒对陈旧口腔拭子的检验效率。方法采用硅珠法提取150份保存7-13年陈旧口腔拭子的DNA,分别用GlobalFiler、PowerPlex 21及Identifiler Plus试剂盒进行扩增检测,比较分析所得分型数据。结果在150份降解样本的检验结果中,GlobalFiler试剂盒21个常染色体STR基因座有效分型检出率为76%,PowerPlex 21试剂盒20个STR基因座检出率为74.93%,Identifiler Plus所含的15个STR基因座检出率为77.56%。结论对于陈旧口腔拭子检材,Identifiler Plus检验成功率最高,需要更多基因座时,GlobalFiler优于PowerPlex 21。

上海市造血干细胞捐献志愿者口腔拭子样本的分型成功率及其影响因素

目的:了解上海市造血干细胞捐献志愿者的口腔拭子样本分型成功率情况,分析其影响因素,为提高口腔拭子样本分型成功率提供参考。方法:利用2015-2018年上海市口腔拭子入库志愿者的8104条口腔拭子样本检测结果和造血干细胞资料库信息,对不同年份、不同采样方式获得的样本分型成功率进行卡方分析,并对口腔拭子样本分型结果的影响因素进行回归分析。结果:2015-2018年,造血干细胞入库志愿者的口腔拭子样本分型成功率逐年上升(P<0.05),2018年的口腔拭子样本与静脉血样本在分型成功率上无差异(P>0.05);logistic回归分析显示,样本分型的有效性在户籍、献血经历与采集检测的时间间隔上差异有统计学意义(P<0.05),送检时间间隔较短、上海户籍以及没有献血经历的志愿者口腔拭子样本具有更高的分型成功率。结论:口腔拭子样本的分型成功率较为理想;志愿者户籍、献血经历和采集检测时间间隔是影响口腔拭子样本分型结果的主要因素,需要优化关键环节来保障口腔拭子技术的有效应用。

50份口腔拭子常规细菌鉴定结果的报告

正常人体口腔中存有大量多种类的细菌。口腔部位的正常菌群对保持宿主的正常健康和正常功能起一定的作用。但正常菌群中的某些细菌在宿主的一般抵抗力及局部免疫力低的情况下,也能引起疾病。为探讨口腔病患者口腔内菌群分布状况,我们对采自口腔病患者的50份口腔拭子进行了常规细菌学鉴定。现将结果作如下报告: 材料与方法 1.培养基来源:自制血平板、麦康凯平板、半固体、三糖铁、硝酸盐、尿素、枸椽酸盐等培养基,采用上海生研所产系列微量发酵管,包括鉴定细菌常用的21种生化反应,另采用开封市医学生物研究所产E—15—B快速生化鉴定系统。(肠杆菌科用)包括16种生化反应。

用拭子提取脱落细胞进行DNA检验

随着DNA数据库的建立，法医DNA检验在刑侦破案中正发挥着越来越重要的作用。采用口腔拭子提取口腔脱落细胞进行DNA检验，取材简便又无创伤，成本低。

口腔黏膜拭子在遗传性耳聋常见致病基因检测中的应用研究

目的：探讨口腔黏膜拭子在遗传性耳聋常见致病基因检测中的应用，为常见耳聋致病基因筛查提供无创的样本采集方式。方法：195例新生儿，经听力筛查被诊断为听力障碍，收集其口腔黏膜拭子和外周血样本，抽提DNA，核酸测定仪检测两种收集方式样本所得DNA质量。对两种样本进行三种常见遗传性耳聋致病基因GJB2基因、SLC26A4基因和线粒体基因12S rRNA全外显子巢式PCR扩增，比较两种方法扩增产物及测序效果。结果：口腔黏膜拭子抽提DNA质量较外周血低，差异具有统计学意义（P〈0．05）；在PCR扩增后，两种样本扩增产物凝胶电泳无明显差异，测序结果无明显差异（P〉0．05）。结论：口腔黏膜拭子作为一种无创的样本采集方式，可用于三种常见遗传性耳聋致病基因检测的样本采集。

上海市中青年人群在造血干细胞采集中口腔黏膜拭子的接受意愿及其影响因素

目的:调查中青年人群在造血干细胞采集中口腔黏膜拭子的接受意愿及其影响因素,为口腔拭子采样工作的开展提供建议。方法:对接受口腔拭子采样的志愿者进行调查,采用单因素分析和logistic回归分析口腔拭子采样入库接受意愿及影响因素。结果:共收集有效问卷1985份,志愿者口腔拭子采样入库的接受率为96.83%;口腔拭子接受意愿在职业、排队等候时间、对口腔拭子技术的认知、采集操作难度、与现场指导人员沟通难度上的差异有统计学意义(P<0.05)。结论:口腔拭子采样社会接受度较高,受职业、认知等因素影响。

深圳市青年同型半胱氨酸及其他临床指标与MTHFR C677T基因的多态性

背景:N5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-methylenetetrahydro-fotate reductase,MTHFR)基因发生突变,易引起高同型半胱氨酸血症,而高同型半胱氨酸血症为脑卒中的独立危险因素。目的:分析深圳地区青年人群同型半胱氨酸水平与MTHFR C677T基因多态性之间的关系,并探讨高同型半胱氨酸血症与其他临床资料之间是否具有相关性。方法:分别收集101例高同型半胱氨酸血症患者作为实验组,101例同型半胱氨酸血值正常者作为对照组(20-45岁)。收集入组人员的口腔唾液标本,用纳米磁珠法提取DNA,PCR扩增目的片段,并将扩增产物送与公司测序。结果与结论:实验组和对照组MTHFR C677T基因的CC型、CT型、TT型3种基因型总体分布频率具有显著性意义(P<0.01),说明深圳地区青年人群同型半胱氨酸水平与MTHFR C677T的多态性具有一定的相关性。实验组中TT型基因频率及T等位基因频率均明显高于对照组,且实验组TT基因型的受试者同型半胱氨酸水平明显高于CT基因型及CC基因型受试者,差异均有显著性意义(P<0.05),说明TT型比CT型更能影响同型半胱氨酸水平。实验组收缩压、舒张压值显著高于对照组(P<0.05),表明高同型半胱氨酸血症可引起血压值增高;试验并不能确定高同型半胱氨酸血症能增高血脂水平。

Leber遗传性视神经病相关的三种原发性线粒体突变的无创检测方法建立

目的:建立1种Leber遗传性视神经病(LHON)相关的3种原发性线粒体突变11778G>A、14484T>C和3460G>A的无创检测方法。方法:研究对象为在温州医科大学附属眼视光医院就诊的3例(WZ1481、WZ1478、WZ1435)基因检测确定为m.11778G>A、m.14484T>C和m.3460G>A突变的LHON患者。采集3例LHON患者和2例野生型健康对照的静脉血样及口腔黏膜细胞样本,然后分别用手工法和试剂盒法提取全基因组DNA,分析比较2种样本、2种方法提取的DNA的纯度及浓度有无差别。最后以携带m.11778G>A、m.14484T>C和m.3460G>A突变的LHON患者和野生型的口腔黏膜细胞和外周血提取的全基因组DNA作为模板,通过PCR扩增分别包含以上3种突变的DNA片段,然后进行焦磷酸测序、斑点杂交和Southern blot分析PCR产物。结果:口腔黏膜细胞和血液提取的DNA浓度的差异无统计学意义(P>0.05)。手工法提取的口腔黏膜细胞DNA纯度低于试剂盒法提取的口腔黏膜细胞和血液DNA的纯度,差异有统计学意义(P<0.05)。口腔黏膜细胞提取的DNA产量与血液相似。DNA测序结果显示血液样本和口腔黏膜细胞样本具有很好的一致性,对照组均检测不到突变,而突变组可以检测到相应的突变。斑点杂交和Southern blot的结果也一致,对照组均为阳性而突变组均为阴性。结论:口腔黏膜细胞DNA可用于筛查和鉴定LHON的3个主要线粒体突变。本研究建立了一种方便、无创的方法来检测LHON相关的m.11778G>A、m.14484T>C和m.3460G>A突变。

纳米磁珠法与试剂盒法分析载脂蛋白E基因的多态性

背景:相对于血液标本,口腔拭子标本更利于大规模载脂蛋白E基因多态性分析的研究,但目前对口腔拭子标本基因组DNA的提取尚无统一方法。目的:探索合适的口腔拭子标本基因组提取方法以分析载脂蛋白E基因的多态性。方法:收集50例散发性阿尔茨海默病患者口腔拭子标本,每份标本分别应用纳米磁珠法与PicoDNA微量核酸提取试剂盒法提取基因组DNA,对比分析两种方法获得的基因组DNA纯度和浓度,后续进行PCR反应,应用DNA电泳确认有无成功扩增出目的条带,通过DNA测序方法分析载脂蛋白E基因的多态性。结果与结论:两种方法提取的基因组DNA纯度均较好,纳米磁珠法提取的基因组DNA浓度要高于PcioDNA微量核酸提取试剂盒法所得浓度(P<0.05)。两组获取的基因组DNA均可成功进行PCR扩增,但电泳结果示纳米磁珠法扩增的目的条带更清楚。两组PCR产物DNA测序结果一致,载脂蛋白E基因ε2、ε3、ε4基因型的比例分别是6%,71%,23%。表明纳米磁珠法相对于PcioDNA微量核酸提取试剂盒法提取口腔拭子标本基因组DNA更适合用于大样本载脂蛋白E基因多态性的研究。

基于PCR-金磁纳米微粒层析技术检测乙醛脱氢酶2基因多态性方法的建立及应用

目的基于"PCR-金磁纳米微粒层析法"建立用于口腔拭子样本类型的乙醛脱氢酶2(ALDH2)Glu504Lys基因分型检测技术。方法以口腔拭子为样本类型,利用ARMS-PCR技术,针对ALDH2 Glu504Lys基因设计特异性引物,在实验室PCR常规反应条件上以金磁纳米层析试纸条为检测平台对各项条件进行优化,以确定最优PCR-金磁微粒ALDH2Glu504Lys口腔拭子反应体系和PCR反应程序。收集60例口腔拭子样本,利用金磁纳米层析检测技术进行检测,并用测序结果进行验证。结果检测的60例口腔拭子样本中杂合突变型16例,野生型42例,纯合突变型2例,金磁微粒层析法检测基因分型结果与测序结果符合率100%。结论建立了基于金磁纳米微粒ALDH2 Glu504Lys口腔拭子基因检测技术,该方法具有快速、简便和准确的特点,迎合了当下POCT的发展趋势,值得临床推广和应用。

儿童氨基糖苷类药物性耳聋基因快速无创检测法的应用

目的:探讨氨基糖苷类药物性耳聋相关基因位点A1555G和C1494T的快速无创检测法在儿童耳聋诊断中的应用。方法:选取2015年5月至2017年5月温州医科大学附属第一医院诊断为非综合征型感音神经性耳聋患儿126例,收集其口腔黏膜拭子及静脉血。采用多重等位基因特异性PCR(MAS-PCR)检测口腔拭子来源DNA中A1555G和C1494T突变情况。同时用Sanger测序法检测静脉血来源DNA中A1555G和C1494T突变情况,并通过Kappa一致性检验分析2种方法检出率的一致性来验证前者的可靠性。结果:采用MAS-PCR检测口腔黏膜拭子来源DNA中A1555G和C1494T突变的检出率为6.35%(8/126),其中A1555G突变7例、C1494T突变1例。静脉血Sanger测序法的检出率为6.35%(8/126),Kappa一致性检验结果显示2种方法检出率一致性较好(kappa=1,P<0.01)。结论:采用MAS-PCR检测口腔黏膜拭子来源DNA中A1555G和C1494T突变是一种简便、快速、无创的检测手段,为婴幼儿,乃至新生儿药物性耳聋检测的开展提供一种可行的方法。

超显检查上呼吸道真菌的形态特征及判定标准

目的:建立实验室检查上呼吸道真菌感染诊断标准。方法:应用超高倍显微诊断系统技术记录口腔咽拭子涂片中真菌孢子及茵丝的形态。结果:口腔咽拭子涂片镜检见簇状排列的孢子、生芽孢子及菌丝,即为阳性,可判定口腔真菌感染。结论:应用超高倍显微诊断技术检查咽拭子中真菌孢子与菌丝形态,可以早期发现和适时诊断念珠菌、曲霉菌、青霉菌、毛霉菌、毛孢子菌等常见真菌呼吸系统吸入性感染。