水泡性口腔炎病毒增殖的初步探讨

自１９５７年Ｉｓａａｃｓ和Ｌｉｎｄｅｎｍａｎｎ发现干扰素至今，已有许多干扰素活性测定方法问世。目前国内外各型干扰素效价测定中，皆乐于使用水泡性口腔炎病毒（ＶＳＶ）作为攻击病毒（１），在本实验室，我们用鸡胚细胞进行ＶＳＶ的增殖，用ＴＣＩＤ５０微量滴定法...

科学家解开囊状口腔炎病毒的3D结构

据美国BIOCOMPARE科技新闻网（2010-03-05）报道,长久以来,囊状口腔炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）就是研究及了解negative-strand RNA病毒的良好模式,这一类病毒通常会引起流行性感冒,麻疹以及狂犬病等,更重要的是,有些研究已显示VSV非常具有潜力能作为抗癌剂,因此,能解开VSV的立体结构,对相关疾病的预防及治疗有很大的作用,此研究由UCLA加州纳米系统研究所、微生物研究所以及免疫及分子遗传研究所的研究团队共同完成,研究由Z.Hong Zhou教授主导,研究成果发表于近期的《科学》（Science）期刊上。

疱疹性口腔炎病毒G蛋白/胸苷激酶逆转录病毒载体转移人视网膜色素上皮细胞及其表达

目的 应用新型逆转录病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶 (herpessimplexvirus thymidinekinase ,HSV TK)基因转移 ,探讨丙氧鸟苷 (ganciclovir,GCV)对HSV TK基因修饰人视网膜色素上皮细胞 (retinalpigmentepithelialcells,RPE)的杀伤抑制作用。方法 生产制备高滴度疱疹性口腔炎病毒G蛋白 (vesicularstomatitisvirus Gprotein ,VSV G) /胸苷激酶 (thymidinekinase ,TK)和VSV G/LacZ病毒 ,对NIH3T3细胞进行VSV G/TK滴度测定 ;VSV G/LacZ感染CRL2 30 2细胞后 ,以X gal染色估计感染率 ;对CRL2 30 2细胞、分离培养的RPE细胞及NIH3T3细胞感染不同病毒滴度的VSV G/TK ,结合GCV作用 ,观察 3种细胞生长抑制率。结果 VSV G/TK滴度为 1 2× 10 8克隆形成单位 /ml;VSV G/LacZ感染CRL2 30 2细胞的X gal染色蓝染细胞率为 5 8% ;当感染复数为 2 0 0时可最大的抑制细胞生长 ,抑制率为 4 5 %。结论 VSV G逆转录病毒可以介导LacZ、HSV TK基因在离体NIH3T3细胞和人RPE细胞中高效转移和表达。被HSV TK基因修饰的细胞对GCV作用敏感 ,其生长受到抑制。

含GFP基因的逆转录病毒与VSV-G蛋白重组形成高滴度假病毒

目的 通过与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)蛋白重组,提高含绿色荧光蛋白(GFP)基因逆转录病毒的感染效率,并使其经受超速离心以达到进一步浓缩。方法 应用GFP-RV质粒转染PT67细胞并用G418筛选出GFP阳性克隆,利用其产生的病毒上清液再转染GP2-293细胞,在G418筛选的同时,瞬时转染VSV-G基因。收集该GP2-293细胞产生的重组病毒作滴度测定,并通过低温超速离心制成含GFP病毒的浓缩液,再感染NIH3T3细胞,观察GFP在NIH3T3细胞内的表达情况。结果 GFP-RV质粒转染PT67细胞产生的GFP阳性克隆,随着细胞传代过程,GFP的表达逐渐减弱。GP2-293细胞转染VSV-G基因后可产生(7.5±1.4)×105cfu/mL的GFP重组假病毒,将其浓缩液转染NIH3T3细胞,可见GFP在细胞内有较强的表达。结论逆转录病毒与VSV-G共转染GP2-293包装细胞可以形成高滴度的假病毒,由此得到含GFP基因的病毒上清液,其在组织工程中应用范围更广泛。

逆转录病毒的高效包装及转基因鸡技术平台的建立

转基因鸡及输卵管生物反应器正日益成为生物领域研究的热点之一,当前研究转基因鸡最成功的方法即为逆转录病毒介导法,但目前国内尚无系统报道逆转录病毒法制备转基因鸡的平台技术。为加快国内这一领域的研究步伐,本文较详尽的介绍了从逆转录病毒包装、竞争法包装泛嗜性VSV-G病毒、病毒包装条件的优化、病毒的浓缩、辅助病毒检测、鸡胚盘下腔注射等方法技术,并分别在体外鸡胚胎原代成肌细胞(CFM)和体内鸡胚中检测目的标记基因GFP的病毒感染整合效率,为今后转基因鸡的研究提供了一个实用的技术平台。

VSV-G蛋白修饰的GFP逆转录病毒的构建及表达

目的通过与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)共转染,使含绿色荧光蛋白(GFP)基因的逆转录病毒经超速离心得以浓缩,进一步提高GFP逆转录病毒的细胞感染效率。方法应用GFP-RV质粒转染PT67细胞,并用G418筛选出GFP阳性克隆,利用其产生的病毒上清液再转染GP2-293细胞,在G418筛选的同时,瞬时转染VSV-G基因。收集该GP2-293细胞产生的重组假病毒液,并通过低温超速离心制备含GFP基因假病毒的浓缩液,测定浓缩前后含GFP基因假病毒液滴度,并分别感染NIH 3T3细胞、软骨细胞、成纤维细胞、骨髓基质干细胞等,荧光显微镜下观察GFP在上述细胞内的表达情况,流式细胞仪检测GFP基因的转染阳性表达率。结果GFP-GP2-293细胞转染VSV-G基因后产生的重组假病毒液滴度为7.36×104CFU/mL,浓缩40倍后其滴度可提高至1.82×106CFU/mL。用浓缩前后含GFP基因假病毒液分别转染NIH 3T3细胞,GFP阳性表达率可由44.21%升高至79.80%;转染兔软骨细胞和成纤维细胞、猪骨髓基质干细胞和脂肪干细胞后,均可见GFP阳性表达明显增强。结论逆转录病毒与VSV-G共转染GP2-293包装细胞可以制备出高滴度的假病毒液。浓缩病毒液的高转染率为其在组织工程种子细胞标记方面的广泛应用奠定了基础。

鸡胚细胞扩增VSV病毒及毒力稳定性的考察

目的:考察我所扩增 VSV 病毒的方法及稳定性。方法:利用鸡胚细胞扩增 VSV 病毒,于24小时收集冻存在液氮罐中。利用稀释法测定病毒的能力。结果:我所扩增的 VSV 病毒毒力随时间延长而下降扩增8周时毒力基本消失。结论:本方法扩增 VSV 病毒尚需进一步提高和完善。

降纤酶制备中层析工艺对病毒去除能力研究

目的:研究降纤酶制备中层析工艺对脂包膜指示病毒伪狂犬病毒(PRV)和水疱性口腔炎病毒(VSV)的去除能力,为该产品的病毒安全性评价提供依据。方法:用微量滴定法测定层析工艺处理前后各批次样品中PRV和VSV的滴度,按Karber法计算病毒滴度,并计算层析处理前后各批次样品中各指示病毒的滴度下降值。结果:层析填料(使用≥108次)对PRV的去除效果为4.28 logs,层析填料(使用≥102次)对VSV的去除效果为4.72 logs;未处理对照中,PRV滴度平均下降0.14 logs、VSV滴度平均下降0.32 logs。结论:降纤酶制备工艺中的层析工艺能有效去除脂包膜指示病毒。

基于对虾白斑综合症病毒极早期启动子的新型杆状病毒表达载体的构建与分析

【目的】构建携带有受杆状病毒多角体启动子控制的疱疹性口腔炎病毒糖蛋白(vesicular stomatitis virus glycoprotein,VSVG)和受白斑综合症病毒极早期基因(immediately-early gene1,ie1)启动子控制的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)两个表达阅读框的新型重组病毒vAc-G-EGFP,分析其在无脊椎动物和脊椎动物细胞系中表达报道基因的能力。【方法】利用Bac-To-Bac系统构建重组杆状病毒,利用病毒感染或转导实验介导报道基因在待测细胞系中的表达,用荧光显微镜和免疫印迹技术分析报道基因在待测细胞系中的实时表达情况。【结果】成功构建了分别含VSVG和ie1启动子两个阅读框的重组杆状病毒vAc-G-EGFP,发现vAc-G-EGFP可以在无脊椎和脊椎动物细胞系中有效表达报道基因EGFP,免疫印迹实验显示,在不同时间点EGFP于这两类细胞中的表达存在差异。【结论】基于白斑综合症病毒ie1启动子并携带有VSVG表达框的单一杆状病毒载体可以实现同时在不同种类细胞系中有效表达外源基因。本文构建的新型杆状病毒表达载体有希望普遍应用于基础和应用生物学研究。