GST-P12融合蛋白的抗体制备、鉴定及免疫组化分析

目的:为了进一步研究p12DOC-1基因及其蛋白在口腔癌发生中的作用与调控机制,将已表达纯化好的GST-p12融合蛋白进行多克隆抗体的制备及鉴定。方法:将构建好的融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1转化BL21(DE3)型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,得到GST-p12融合蛋白,经亲和层析柱纯化后电泳,再割胶研磨作为抗原直接免疫家兔,经Western blot及ELISA检测抗体效价及特异性并做免疫组化分析。结果:得到较高纯度的GST-p12融合蛋白,获得了兔来源的抗p12DOC-1血清,经蛋白免疫印迹杂交反应及免疫组化分析证实所得的抗体具有较高的特异性和效价。结论:成功制备了兔抗人的p12DOC-1抗血清,为进一步研究p12DOC-1在口腔癌中发生缺失的机理打下基础。

DOC-1基因的原核表达载体构建及其重组蛋白的表达纯化

目的:克隆DOC-1基因、构建原核表达载体并纯化出其重组蛋白。方法:从人胎脑组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增DOC-1的CDS序列,再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMD18-T和pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化E.coliBL21,用IPTG诱导表达,GlutathioneSepharose4B柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:电泳证实RT-PCR扩增产物与预期目的基因DOC-1长度一致,测序结果与GenBank公布的DOC-1基因序列完全一致,IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量38000左右出现新的蛋白表达条带,经亲和层析柱纯化后得到高纯度的GST-p12重组蛋白。结论:成功构建了pGEX-4T-1-DOC-1原核表达载体,表达并纯化出GST-p12重组蛋白,为进一步研究p12DOC-1蛋白打下了实验基础。