产黑普氏菌刺激原代人口腔角质细胞的时间序列基因表达谱研究

目的基于时间序列分析,研究产黑普氏菌(Prevotella melaninogenica,Pm)刺激原代人口腔角质形成细胞(primary human oral keratinocytes,pHOKs)后基因表达的时间趋势,以探究Pm与pHOKs相互作用的潜在机制。方法利用生物信息学方法分析pHOKs分别与Pm共培养4、24 h后的高通量测序结果,使用Mfuzz聚类算法将具有相似时间表达模式的基因划分聚类,并进行GO、KEGG以及STRING网络分析,进一步利用Cytoscape软件取交集得到枢纽基因(Hub基因)。采用实时荧光定量PCR检测Hub基因的表达。结果Pm刺激pHOKs 4、24 h分别有1456个和1386个差异表达基因。通过Mfuzz将其划分为3个聚类,其中簇1基因随时间延长其表达呈现下降的趋势,主要参与上皮细胞分化和上皮细胞向间充质细胞转化等生物学过程;簇2基因随时间延长其表达呈现上升的趋势,主要参与细菌感染、视黄醇代谢等过程;簇3基因表达在刺激前期上调、后期下调,主要参与细胞因子相关信号通路等过程。在PPI网络中筛选出簇1 Hub基因为VEGFA、GDNF;簇2中的Hub基因为PTGS2、ICAM1等;簇3中的Hub基因为IL-6、CCL2等。RT-qPCR检测结果显示,VEGFA、PTGS2、IFIT1、IRF1与测序数据中随着时间延长基因的表达趋势一致。结论本研究对Pm刺激pHOKs过程中相关生物学分子的动态模式进行了深度挖掘,发现与视黄醇代谢相关的基因以及负调控EMT的基因在OLP中异常表达,Pm入侵上皮细胞后可能通过一些适应性机制逃避免疫监视,该发现有助于进一步探究Pm在口腔扁平苔藓中的致病机理。

槟榔提取物对口腔上皮细胞生物功能影响的研究

目的探讨槟榔提取物(ANE)对人口腔上皮细胞的生物学功能影响。方法本研究首先分析了梯度浓度ANE下对人口腔角质细胞(HOK)增殖的影响;采用第二代RNA测序分析对照组与ANE干预组HOK细胞的差异表达基因。随后,流式细胞术用于检测HOK细胞周期和凋亡;β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色试剂盒用于检测细胞衰老;免疫荧光实验检测HOK细胞中Ki67和γH2AX蛋白的表达;实时聚合酶链反应(RT-PCR)用于检测衰老相关表型基因白细胞介素(IL)-6、基质金属蛋白酶-2(MMP2)和TGFB1表达;免疫印迹用于检测自噬相关蛋白(LC3-Ⅰ/Ⅱ和p62)和上皮间充质转化(EMT)相关蛋白(SMAD2、p-SMAD2、E-Cadherin和Vimentin)的表达;酶联免疫吸附实验用于检测HOK细胞外分泌蛋白TGFB1表达。结果测序结果显示ANE可引起HOK细胞细胞周期、p53、自噬、FoxO、细胞衰老等信号通路相关基因异常表达。流式细胞术显示ANE可诱导HOK细胞凋亡和G2/M期阻滞。与对照组相比,ANE处理后的HOK细胞衰老细胞数量增加,衰老相关表型基因IL-6、MMP2和TGFB1表达上调。此外,相较于对照组,ANE组中HOK细胞的γH2AX、LC3-Ⅱ、TGFB1、p-SMAD2和Vimentin蛋白表达增加,Ki67蛋白、LC3-Ⅰ和E-Cadherin蛋白表达下降。结论ANE可诱导HOK细胞凋亡、G2/M期阻滞、衰老、DNA损伤、自噬和EMT,形成促癌的细胞微环境。

自体血清与胎牛血清培养口腔黏膜角质细胞及上皮组织的实验研究

目的探讨自体血清培养人口腔黏膜角质细胞的可行性,为组织工程口腔黏膜用于临床提供理论和技术依据。方法应用自行制备的含10%、20%和30%自体血清的培养液及10%胎牛血清培养液,对人口腔黏膜角质细胞进行培养。对比观察不同浓度自体血清和胎牛血清培养的口腔黏膜角质细胞及上皮组织生长情况,绘制10%自体血清组及10%胎牛血清组细胞生长曲线及计算其倍增时间。并行抗-HLA免疫荧光检测培养上皮。结果各浓度自体血清组和10%胎牛血清组细胞生长及形态无明显差别,10%自体血清组细胞倍增时间为24.02±1.80h,与10%胎牛血清组20.90±0.79h比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组细胞24h克隆形成率比较,差异均无统计学意义(P>0.05);随自体血清浓度升高获得黏膜上皮面积增大,厚度增加,以20%自体血清组最为明显,与10%胎牛血清组培养黏膜上皮比较,差异有统计学意义(P<0.05)。各组培养上皮经抗-HLA免疫荧光检测为阳性。结论制备的自体血清能完全替代胎牛血清对口腔黏膜角质细胞进行培养,且培养的口腔黏膜上皮组织分化优于胎牛血清。

白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞的作用研究

目的研究白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞的作用机制。方法将培养的口腔黏膜上皮角质细胞分别加入孢子型白色念珠菌(孢子组)和菌丝型白色念珠菌(菌丝组),另将单独培养的口腔黏膜上皮角质细胞作为阴性对照组。比较各组对口腔黏膜上皮角质细胞的黏附作用,并观察白色念珠菌对口腔黏膜上皮角质细胞的凋亡和增殖作用。结果菌丝组黏附指数(7.63±1.39)显著高于孢子组(3.47±1.04),差异有统计学意义(P<0.05);菌丝组凋亡率[(3.49±0.4)%]显著高于孢子组[(2.07±0.15)%]和阴性对照组[(1.98±0.07)%],差异有统计学意义(P<0.05),而孢子组和阴性对照组凋亡率相比差异无统计学意义(P>0.05)。菌丝组G0/G1期细胞比例[(38.17±7.83)%]显著低于孢子组[(49.47±11.41)%]和阴性对照组[(57.71±9.39)%],差异有统计学意义(P<0.05);S期[(8.54±4.03)%]、G2/M期[(20.18±9.59)%]细胞比例上升,且显著高于孢子组[(6.47±2.73)%、(10.71±3.19)%]和阴性对照组[(5.35±2.11)%、(12.38±4.35)%],差异有统计学意义(P<0.05);PI[(42.79±18.73)%]明显高于孢子组[(28.67±8.79)%]和阴性对照组[(26.87±7.64)%],差异有统计学意义(P<0.05),而孢子组和阴性对照组PI相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论白色念珠菌能够导致口腔黏膜上皮角质细胞发生凋亡和增殖周期改变。

D-半乳糖诱导正常人口腔黏膜角质形成细胞衰老的研究

目的:明确D-半乳糖对正常人口腔黏膜细胞(normal human oral keratinocytes,NHOKs)促衰老作用,并探索潜在机制。方法:体外分离培养NHOKs,角形蛋白和波形蛋白免疫细胞化学染色法鉴定NHOKs。分别以10、20、40、80g/L D-半乳糖处理诱导细胞作为实验组,正常培养液组作为对照组。通过CCK-8法检测细胞增殖活力,采用衰老相关β半乳糖苷酶染色(senescence-associated-β-galactosidase,SA-β-gal)分析细胞衰老情况,Western blot检测衰老相关蛋白p53和p21表达水平。活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测细胞内氧化应激水平,Western blot检测氧化应激相关蛋白sirt1的表达。结果:D-半乳糖抑制NHOK细胞增殖,具有时间和浓度依赖性。D-半乳糖增加SA-β-gal染色阳性率,上调衰老相关基因p53和p21,显著升高细胞内ROS,降低氧化应激相关蛋白sirt1表达。结论:D-半乳糖可诱导NHOKs发生衰老,该过程可能与细胞氧化应激有关。

白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞凋亡和增殖的影响探讨

目的探讨分析白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞(HOK,human oral keratinocytes)凋亡和增殖的影响。方法选取2015年8月-2016年8月期间我院66例体检健康者颊黏膜,对HOK进行培养,于菌丝型和孢子型白色念珠菌中加入制备的HOK,并分组,前者作为菌丝组,后者作为孢子组,而对照组则为单纯HOK,通过对比研究的方式,探讨白色念珠菌对HOK产生的影响。结果菌丝组凋亡率、G_0/G_1期、S期、G_2/M期、PI与对照组、孢子组对比(P<0.05),而孢子组与对照组在凋亡率、G_0/G_1期、S期、G_2/M期、PI方面对比,差异不明显(P>0.05)。结论 HOK的增殖和凋亡与白色念珠菌有着密切关系,其能够引起HOK在调往率方面表现出升高的趋势,改变HOK增殖周期。

白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞的黏附作用及影响因素研究

目的 研究白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞（human oral keratinocytes,HOK）的黏附作用及影响因素.方法 本研究于2012年8月至2014年3月在中国医科大学附属口腔医院中心实验室完成.体外培养白色念珠菌和HOK,在不同浓度、温度和pH值条件下,用白色念珠菌浊悬液感染HOK,并进行革兰染色,油镜下观察,计算黏附指数、黏附率.结果 在同一浓度下,菌丝相的白色念珠菌黏附率明显高于孢子相的;随着白色念珠菌浓度的升高,黏附率也有所增加.另外,白色念珠菌浓度为107 CFU/mL与HOK的细胞浓度为105个/mL时黏附基本达到饱和,可作为后续试验的最佳浓度.随着温度升高,白色念珠菌的黏附率也随之增加.黏附的最适宜pH值范围是6.0～8.O.结论 白色念珠菌黏附率的增加与菌丝的形成有关,有利于菌丝形成和生长的条件均可提高黏附率.

白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞凋亡和增殖的影响

目的:探索白色念珠菌对人口腔黏膜上皮角质细胞(KB细胞)凋亡和增殖的影响。方法:分别培养孢子型白色念珠菌和菌丝型白色念珠菌,取健康志愿者的颊粘膜制备KB细胞,分别加入孢子型白色念珠菌(孢子组)和菌丝型白色念珠菌(菌丝组),另外取单纯KB细胞作为对照组。对比分析各组细胞凋亡率及各个周期的细胞数,统计分析各组细胞增殖指数(PI)。结果:菌丝组凋亡率显著高于对照组及孢子组(P<0.05);菌丝组在G0/G1期的细胞比例均显著低于对照组及孢子组(P<0.05);菌丝组在S期和G2/M期的细胞比例均显著高于对照组及孢子组(P<0.05);菌丝组的PI显著高于孢子组和对照组(P<0.05)。结论:菌丝型白色念珠菌可诱导KB细胞凋亡率的上升及改变KB细胞周期变化,并引起KB细胞的PI升高,对于临床上治疗口腔念珠菌病具有重要的指导意义。

核受体共激活因子7在槟榔碱诱导的上皮间充质转化中的生物学功能

目的研究核受体共激活因子7(nuclear receptor coactivator 7,NCOA7)在口腔黏膜下纤维性变(OSF)中的表达及意义,并探讨其在人口腔角质细胞株HOKs间充质转化过程中的作用。方法收集OSF组织30例及正常口腔黏膜组织15例,采用免疫印迹法检测NCOA7、上皮间充质转化相关标记物在OSF组织及正常黏膜组织中蛋白水平的表达情况;以Western blot法检测槟榔碱刺激后HOKs中NCOA7、上皮及间充质标记物的蛋白水平变化。结果 NCOA7在30例OSF组织高表达(P<0.05);同时在细胞基底层出现间充质标记物的阳性表达。NCOA7在槟榔碱刺激的HOKs中高表达,且具有槟榔碱浓度依赖性(P=0.004 3);随着槟榔碱浓度的升高,上皮标志物表达逐渐下调,间充质标记物表达逐渐升高。结论口腔黏膜下纤维性变组织中高表达的NCOA7,可能参与调控上皮细胞间充质转化过程,进一步促进纤维化进程。

牙科材料导致的苔藓样黏膜反应机制的研究进展

目的为了解目前牙科材料导致的苔藓样黏膜反应研究状况,作者回顾了近年来的研究文献。方法从粘膜的病理解剖的角度整理他人的研究成果,对口腔角质形成细胞、淋巴细胞浸润带以及二者之间的相互作用进行了归纳。结果牙科材料导致的苔藓样黏膜反应的主要枢纽是口腔角质形成细胞,它既是多种T淋巴细胞趋化因子的生产细胞,也是重要的外源性抗原提呈细胞。结论病损局部的口腔角质形成细胞成为了T淋巴细胞攻击的靶细胞。