国内外口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测方法的比较

对国内外3种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA检测方法和1种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体阻断ELISA检测方法,在检测牛血清时的敏感性和特异性进行比较,以期获得可应用于口蹄疫检疫的有效试剂盒。采用国内外3种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体间接ELISA试剂盒和1种阻断ELISA试剂盒,对150份牛血清样品进行ELISA检测。同时对150份样品进行非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验(EITB),以评估4种ELISA检测结果。结果 4种试剂盒的敏感性均达到100%,特异性分别为100%、95%、73%、99%。结论:国内生产的口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体检测试剂盒可以用于牛口蹄疫血清学筛选性试验。

免疫层析试纸条检测口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的研究

为建立口蹄疫(FMD)快速检测方法,本研究以纯化的FMD病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3ABC作为捕捉抗原,金标FMDV抗原作为金标试剂,建立了检测FMDNSP3ABC抗体的胶体金免疫层析试纸条(ICS)。应用FMDICS试验与UBIFMDNSP酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对反刍动物、猪的FMD标准阳性血清的不同滴度进行测定,结果表明ICS在检测反刍动物血清时的检测下限(1∶64)与ELISA(1∶128)接近,而检测猪血清时的检测下限(1∶8)低于UBINSP-ELISA试剂盒(1∶64)。同时用ICS和UBINSP-ELISA检测313份牛血清和111份羊血清,结果ICS检测牛血清时的敏感性和特异性分别为81.81%和96.69%,检测羊血清时敏感性和特异性分别为88.88%和95.10%;ICS与UBINSP-ELISA用于检测牛血清时符合率为95.52%,用于检测羊血清时的符合率为94.59%。结果表明ICS适合在基层单位或养殖场进行自行检测。

口蹄疫非结构蛋白3ABC的融合表达及纯化研究

扩增了口蹄疫非结构蛋白 3ABC基因 ,经双酶切后与表达载体pQE30Xa连接 ,构建了重组质粒pQE3ABC ,并转化到宿主菌M15中进行表达 ,并对表达条件进行了优化。Western -blot结果表明 ,所表达的蛋白氨基酸序列正确 ,且表达的融合蛋白可与标准抗FMDV -O抗体特异性结合。本研究在大肠杆菌中成功地表达了口蹄疫非结构蛋白 3ABC 。

两种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测方法的比较

对常用的兰州兽医研究所和北京世纪元亨生产的两种口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的ELISA检测方法,在检测猪血清抗体时的敏感性进行比较,以期获得可应用于口蹄疫检疫的最佳试剂盒。采用上述两种阻断ELISA试剂盒对170份猪血清样品进行ELISA检测。结果表明,两种试剂盒的阳性检出率相差不大,阳性检出率分别为5. 29%和5. 88%。本试验表明:兰州兽医研究所和北京世纪元亨生产的口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体检测试剂盒检测结果差异不大,均可应用于口蹄疫血清学筛选性试验。

口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的高效表达

将牛源O型口蹄疫病毒(Foot and mouthdiseasevirus,FMDV)China/99株非结构蛋白基因3ABC从pGEM T 3ABC重组质粒中亚克隆到原核表达载体pTriEx 4Neo上,成功构建重组表达质粒pTriEx 3ABC。将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,表达产物经SDS PAGE可检测到分子量约为59 1ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的31 4%。Westernblotting分析证明表达产物能被FMDV阳性血清所识别。表达产物纯化后作抗原进行ELISA检测,结果表明,表达的蛋白显示特异的免疫学活性,并能区分自然感染动物和注苗动物。研究为以FMDV非结构蛋白为抗原,建立自然感染动物和注苗动物的鉴别诊断方法提供了材料。

口蹄疫病毒非结构蛋白3abc基因的克隆与表达

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus , FMDV)非结构蛋白(NSP)-3ABC可用于注苗与感染动物的鉴别诊断,合成该基因的PCR引物,并在引物5 端和3 端分别加入含BamH I和Hind III限制性酶切位点序列。以FMDV毒株基因组RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增3abc基因,得到的基因片段与T载体连接,转化DH5α。提取重组载体pT-3ABC,经BamH I/Hind III双酶切后与载体pET32a连接,转化宿主菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE及Western Blotting检测和鉴定结果表明,在大肠杆菌中成功表达了NSP-3ABC蛋白,分子量约56kDa,且该表达产物可与FMDV感染的动物血清产生免疫反应。ELISA试验结果显示,表达蛋白可用于FMDV注苗与感染动物的鉴别诊断。

口蹄疫3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒适用范围探讨

为了调查口蹄疫3ABC非机构蛋白抗体在临床诊断健康的动物体内是否存在,以及探索3ABC抗体检测试剂盒的适用范围,设计此试验。随机选取新乡市辖区范围内的猪场4个、牛场12个、羊场9个,采集动物全血,分离血清,利用间接ELISA方法(3ABC-I-ELISA)和荧光PCR方法分别检测免疫过口蹄疫疫苗的健康猪、牛、羊体内非结构蛋白3ABC抗体存在情况和血清中口蹄疫病毒存在情况。结果发现,临床健康动物也会产生口蹄疫3ABC非结构蛋白抗体,且动物日龄越大,产生抗体的比例越高。表明口蹄疫3ABC非结构蛋白抗体不仅在野毒感染动物(包括隐性感染动物)体内产生,而且在健康动物中由于免疫频率的增加和免疫剂量的加大也会产生。因此,口蹄疫3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒只适用于对口蹄疫疫情的初筛,且在日龄较小或免疫口蹄疫疫苗次数较少的动物更加适用。

口蹄疫病毒3ABC非结构蛋白抗体检测结果分析

随机选取猪、牛、羊场不同日龄动物血清,利用间接ELISA方法（3ABC-Ⅰ-ELISA）检测接种口蹄疫病毒疫苗的健康猪、牛、羊体内非结构蛋白3ABC抗体存在情况.结果发现临床健康动物也会产生3ABC非结构蛋白抗体,且动物日龄越大,产生抗体的比例越高.这可能与日龄越大的动物在生长过程中感染口蹄疫的概率越大有关,或与多次疫苗免疫后导致产生非结构蛋白抗体有关.因此,口蹄疫3ABC非结构蛋白抗体检测适用于对口蹄疫疫情的初筛,且对日龄较小或免疫口蹄疫疫苗次数较少的动物比较适用.

口蹄疫病毒非结构蛋白3B真核表达载体的构建及表达

设计、合成FMDV非结构蛋白 3B基因的PCR引物 ,并在引物 5’端和 3’端分别加入含BamHI和HindⅢ限制性酶切位点序列。以FMDV基因组RNA为模板 ,利用RT_PCR技术扩增 3B基因 ,得到的基因片段经BamHI/HindⅢ双酶切后与转座载体pFASTBACHTa连接 ,转化宿主菌DH10BAC ,在含庆大霉素、卡那霉素、X_gal、IPTG的LB平板上 37℃培养 2 4h ,提取白色菌落 ,从中提取重组穿梭载体Bacmid 3B ,与脂质体共同转染昆虫细胞sf9,得到重组杆状病毒 ,病毒经传代扩增后感染High 5细胞 ,表达目的蛋白———FMDV非结构蛋白 3B。SDS_PAGE及WesternBlot结果显示 ,本研究成功构建了Bacmid_3B重组表达载体 ,并在昆虫细胞中表达了NSP_3B蛋白 ,该表达产物可与FMDV感染的猪、牛血清产生免疫反应。

口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb)。方法:以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选,有限稀释法克隆,直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体,用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定。结果:免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选,共获得5株抗pET28a-3D的mAb,其亚类鉴定3株为IgG1,2株为IgG2b,初步判定所得5株mAb识别2个不同表位。Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDVO/China99感染的BHK-21细胞中的3D抗原均特异性结合,免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白。结论:成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb,为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础。

区分动物疫苗免疫与病毒感染的口蹄疫非结构蛋白3AB鉴别诊断试剂盒的研制

以口蹄疫非结构蛋白3AB作为抗原的ELISA,适用于鉴别诊断感染和注苗动物。以3ABC基因片段为模板,经RT-PCR扩增得到3AB基因片段,与pET32a连接后,转化宿主菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,表达的重组3AB蛋白,分子量约为50Ku,ELISA结果显示,重组3AB蛋白可用于猪、牛口蹄疫病毒感染与疫苗免疫抗体的鉴别诊断。

口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备与鉴定

用E.coli原核表达并纯化的口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)非结构蛋白3B免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA筛选出分泌鼠IgG的杂交瘤细胞株,将该杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水,用间接ELISA法筛选获得6株能稳定分泌抗3B蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E5、4B1、4D7、4E11、7B2、8B11。鉴定结果显示,4B1和4E11细胞分泌IgG1,其余4株细胞分泌IgG2b;纯化后6株腹水单抗的纯度达90%以上,对3B蛋白的ELISA滴度均可达到1∶100000以上;6株单抗均不与FMDV结构蛋白VP1和3D非结构蛋白发生反应;间接免疫荧光试验证明所制备的单抗能够识别3B蛋白;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存6个月后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。

三种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体ELISA检测方法的比较

本试验选择3种国内外口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC阻断ELISA抗体检测试剂盒,对牛、羊、猪等易感动物血清进行检测,比较3款检测试剂盒质量,以期获得可应用于口蹄疫血清学筛选的有效试剂盒。应用瑞普生物、某国内厂家、某进口试剂盒3种ELISA试剂盒同时对79份血清样品进行ELISA检测,结果显示,3种试剂盒的阳性检出率分别为56.96%、56.96%、55.7%,阳性血清的符合率为95.6%;同时对比瑞普公司2批次试剂盒,发现2次结果完全一致。对感染口蹄疫后不同时间的牛血清进行检测,结果显示3种试剂盒均可用于感染10 d后牛血清样品的检测。试验证实3种非结构蛋白3ABC抗体检测试剂盒检测结果差异不大,均可应用于牛、羊、猪的口蹄疫感染血清学筛选性试验。

口蹄疫病毒非结构蛋白3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测

【目的】口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP)3A、3B和2C基因的表达及产物纯化与活性检测。【方法】利用原核表达系统表达了FMDV NSP 3A、3B和富含B细胞抗原位点序列的2C蛋白。利用高浓度尿素裂解包涵体,采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对2C蛋白进行复性。用金属鳌合亲合层析的方法对表达的FMDV NSP 3A、3B和2C进行纯化。采用ELISA方法对比检测了3种纯化蛋白在检测羊血清NSP抗体的效果。【结果】检测得知3A和3B为可溶性表达蛋白,2C以包涵体形式表达。通过Western-blot分析,表明纯化后蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应。纯化的3A、3B和复性后的2C融合蛋白与3ABC抗原的检测结果具有很高的符合性。【结论】该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫电转移印迹技术(EITB)提供了所需的材料。

检测猪血清口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3AB经纯化后作为抗原,建立了3AB间接ELISA方法,该方法可用于判定被检动物是否感染了口蹄疫病毒.重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以兔抗猪IgG/HRP酶结合物作为第2抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法.用该方法检测了大量不同背景的猪血清,并与3ABC-I-ELISA检测结果进行比较.结果表明:3AB-I-ELISA和3ABC-I-ELISA的总符合率为98.9%,而且3AB-I-ELISA的特异性高于3ABC-I-ELISA.

口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因的克隆表达及3B-EL ISA鉴别诊断方法的初步建立

从口蹄疫病毒(foot-and-m ou th d isease v irus,FM DV)细胞培养物中提取总RNA,经一步法RT-PCR获得了长约230 bp的3B基因片段,将PCR产物连接到pM D-18T载体上并测序,用B amHⅠ与H indⅢ双酶切后,将3B基因融合到pGEX-KG载体上形成表达质粒pGEX-KG-3B,转化到BL 21(DE 3)中在27℃诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质斑点EL ISA。结果表明3B基因主要以可溶形式高效表达,表达产物具有免疫原性。以纯化的表达产物为抗原建立了间接酶联免疫吸附试验(I-EL ISA)。方阵滴定其最佳包被浓度是6.1μg/孔,最佳血清稀释倍数为1∶80,通过测定36份FM DV阴性血清,确定了该方法的阳性判定标准。结果表明,该方法特异性强、重复性好;用3B-EL ISA方法与美国联合生物医学公司(U B I)生产的合成肽检测试剂盒U B I○RFM DV N S-EL ISA对比检测44份血清样品,符合率为93.1%。证明3B-EL ISA方法可用于口蹄疫的鉴别诊断。

口蹄疫病毒O/Laos/00株非结构蛋白3A基因特征分析

经反转录聚合酶链式反应(RT_PCR)技术扩增得到口蹄疫病毒O/Laos/00株的非结构蛋白3A基因核苷酸序列,与其他8株代表性参考毒株的3A基因进行比较,分析口蹄疫病毒3A基因的特征。结果表明:O/Laos/00株3A基因含有429核苷酸,编码143氨基酸残基。9株病毒3A氨基酸序列相比较,可分成3种不同的类型:一类是具有全长3A的毒株,一类是具有133～143位氨基酸缺失的毒株,这两类毒株均来源于牛体,核苷酸差异小(<15%);另一类是具有93～102位氨基酸缺失的毒株,毒株相互之间核苷酸差异较大(7.25%～22.2%)。

口蹄疫病毒非结构蛋白3D原核表达、纯化和反应原性分析

采用RT-PCR技术扩增获得口蹄疫病毒(FMDV)细胞毒O/Akesu/58的非结构蛋白3D(NSP 3D)基因编码区,并定向克隆到pProexHTb原核表达载体上,再将重组pProex-3D转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达产物用亲和层析法纯化,经SDS-PAGE鉴定和Western-blot分析抗原性;以纯化的表达蛋白免疫豚鼠制备其多克隆抗体,ELISA测定抗体效价,间接免疫荧光法检测制备的豚鼠抗NSP 3D多克隆抗体与细胞毒天然抗原的反应原性.结果表明:表达的目的蛋白大小为53ku左右;ELISA结果表明,制备的多克隆抗体效价达1∶1 024以上;Western-blot分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应;间接免疫荧光检测发现,豚鼠抗3D蛋白多克隆抗体可与细胞毒天然抗原反应,与阴性对照未见反应.

口蹄疫病毒非结构蛋白3D^pol的研究进展

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。FMD是OIE规定的A类动物疫病之一,严重影响畜牧业的发展,对世界公共卫生存在着巨大影响，造成巨大的经济损失，素有“政治经济病”之称。

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB基因在毕赤酵母中的表达

目的利用毕赤酵母系统表达口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3AB,用于FMDV感染与疫苗免疫动物的鉴别诊断和3AB蛋白功能研究。方法采用PCR方法从pGEM-T-Easy-3ABC质粒中扩增3AB基因,将其插入pPICZαA酵母表达载体中,构建的重组表达质粒线性化后电转入毕赤酵母GS115中,在0.5%甲醇诱导下表达3AB蛋白,运用SDS-PAGE和ELISA方法鉴定表达蛋白。结果成功构建了pPICZαA-3AB重组酵母表达质粒,并转化入毕赤酵母GS115中,SDS-PAGE和ELISA鉴定结果表明,重组酵母菌株表达出约19kD的3AB蛋白,与针对FMDV的3AB蛋白单克隆抗体有特异性反应。结论在毕赤酵母中成功表达了FMDV3AB蛋白,与抗FMDV3AB蛋白单克隆抗体具有反应性。