山羊同时接种口蹄疫O-A-亚Ⅰ型三价灭活疫苗和小反刍兽疫活疫苗后30d内抗体动态研究

随机选择从未接种过小反刍兽疫(PPR)、口蹄疫(FMD)O-A-亚Ⅰ型三价灭活疫苗且经检测体内未含相关抗体的健康山羊40只,随机分成4组:第1组接种小反刍兽疫活疫苗,第2组接种口蹄疫O-A-亚Ⅰ型三价灭活疫苗,第3组同时接种小反刍兽疫活苗、口蹄疫O-A-亚Ⅰ型三价灭活疫苗,第4组不接种任何疫苗作为对照组,观察各组免疫副反应。在接种后7、14、21、28 d采血,用ELISA抗体检测试剂盒检测抗体动态。结果显示,接种后7 d时PPR单独免疫组和联合免疫组中PPR抗体阳性率均能达到80%;14~28 d时PPR抗体阳性率均能达到100%,PPR组和联合免疫组中同期PPR抗体OD450nm值之间比较差异均不显著;接种后第7天时FMD O-A-亚Ⅰ型三价灭活疫苗单独免疫组和联合免疫组中FMD O型抗体阳性率均能达到60%,14 d时FMD O型抗体阳性率均能达到100%;接种后14 d时FMD OA-亚Ⅰ型三价灭活疫苗单独免疫组和联合免疫组中亚FMD亚Ⅰ型和A型抗体阳性率均能达到国家规定的70%的标准。

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒双拷贝VP1基因的串联表达及其免疫原性

口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因含有T细胞和B细胞表位,是口蹄疫病毒的主要免疫原性基因。作者将亚洲Ⅰ型FMDV VP1基因首尾串联构建双拷贝的VP1基因(2VP1),实现双拷贝VP1基因的原核表达,表达的重组蛋白(GST2VP1)经Sephadex-G200分子筛层析纯化后,Western blot证实其有反应原性,动物试验表明重组蛋白在加强免疫后能够产生和灭活疫苗相当的ELISA抗体和中和抗体;本试验结果为亚洲Ⅰ型FMDV免疫原性研究及GST2VP1蛋白的进一步应用奠定了基础。

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸检测标准物质的制备研究

针对目前口蹄疫病毒核酸扩增检测缺乏标准物质的现状,以口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型核酸为模板,分别设计引物扩增具有检测意义的5′端1nt～2208nt的片段(含完整的5′NCR)和3012nt～5155nt片段(含完整1D～2B区域),并克隆于pMD20-T。测序后采用体外转录方法制备2种RNA纯品,进行初步定量稀释后等量混合分装。采用荧光定量RT-PCR方法进行均匀性和稳定性检验后,委托外部实验室对RNA片段进行拷贝数定值。结果显示,制备的标准品均匀性和稳定性良好。

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及表达

从亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒中提取总RNA,采用反转录聚合酶链反应获得了长度约为700bp的核苷酸片段,大小与预期长度相符。扩增产物经克隆测序,证明其为VP1基因。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX 4T 1,成功构建了重组表达质粒pGEX VP1;利用IPTG诱导,表达出了53ku的目的蛋白条带。Western blotting分析表明,表达产物能与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒抗血清特异性结合。亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP1在大肠埃希氏菌中表达成功。

口蹄疫O-A-AsiaⅠ型三价灭活疫苗免疫效力和最小免疫剂量的研究

为确定口蹄疫O-A-AsiaⅠ型三价灭活疫苗的安全性和免疫效果，按OIE口蹄疫疫苗效检标准和我国口蹄疫灭活疫苗质量标准，对实验室条件下制备的4批疫苗进行了安全性试验、免疫效力试验、免疫持续期试验、疫苗保存期试验和最小免疫剂量试验。结果显示，4批疫苗均对靶动物和实验动物安全，无任何毒副反应；对O、A、AsiaⅠ型口蹄疫的平均免疫效力分别为4．73、6．84和8．10PD50／头份；一次接种的有效免疫期达6个月；2～8℃下的疫苗保存期为12个月；适宜的免疫剂量为，6月龄以上牛每头3．0mL，6月龄以下牛每头1．5mL。该疫苗对接种动物安全，免疫效果良好，一次接种可同时预防O、A、AsiaⅠ型3个血清型的口蹄疫。

双佐剂口蹄疫A型、O型和亚洲Ⅰ型三价灭活疫苗的临床试验

对中试生产的3批双佐剂口蹄疫A型、O型和亚洲Ⅰ型三价灭活疫苗在新疆的阿克苏、伊犁、昌吉等地区进行了临床试验,以进一步评估疫苗的安全性、效力和免疫持续期。结果显示,所有免疫的3 682头牛和33 240只羊（包含怀孕动物和幼畜）食欲、精神均正常,孕期动物无流产,对幼畜生长无影响,无其他不良反应,整个试验期内入试牛羊无口蹄疫发生。经200多头免疫牛6个月的定期采血,用液相阻断ELISA方法检测,显示免疫后第1~2个月内抗体滴度达到最高峰,几何均值最高A型可达1∶558、O型可达1∶332、亚洲Ⅰ型可达1∶381;随后抗体水平有所下降,在第3个月后维持在一定的滴度直至第6个月。结果表明,该疫苗安全、可靠。

奶牛口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗免疫效果对比试验

为了解兰州地区奶牛口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的免疫效果,科学评价免疫质量以及合理制定口蹄疫疫苗免疫程序,本研究应用液相阻断ELISA和O型正向间接血凝检测方法分别对目前兰州地区使用的4种口蹄疫二价灭活疫苗的免疫效果进行了对比。结果表明,兰州地区使用的4种口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的O型和亚洲Ⅰ型口蹄疫保护性抗体诱导能力参差不齐,其中以B公司O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的抗体诱导能力最强,其他3个公司的疫苗则相对较差。

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其免疫活性的初步分析

提取亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒总RNA,用特异性引物通过RTPCR反应获得了约750bp的核酸片段,将其与pGEMTEasy载体连接,并转化大肠埃希氏菌JM109。重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序,证明所克隆的片段含有完整的VP1基因;将重组质粒与表达载体pcDNA3.1(+)分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后连接,构建成重组表达质粒,转化宿主菌DH5α,筛选阳性克隆。测序结果证明,目的基因正确插入到表达载体中,命名为pcDNAV;用同样方法将IL18基因插入pcDNAV中,命名为pcDNAVI。用pcDNAVI免疫豚鼠,2周后加强免疫1次,每周用ELISA检测豚鼠血清中的抗体水平。结果表明,pcDNAVI可引发机体产生体液免疫。

猪的亚洲Ⅰ型口蹄疫的发病特点及控制措施研究

口蹄疫是偶蹄动物的一种重要的烈性传染病,在没有更好的防控方法之前,全群扑杀就是最稳妥的办法,也是出于全局考虑。作为广大科技工作者,应该勇于实践科学发展观,探寻更具成效的疫病防控方法,促进畜牧业发展。本文研究记录了一起发生在某猪场的产仔舍的亚洲Ⅰ型口蹄疫的发病接触性传播不强,很少自然感染2周龄以上仔猪的特点;并提出了用停止哺乳和捕杀发病猪只的办法来控制本病继续发展的控制措施,供广大科研工作者探讨,但在生产实践中仍需谨慎对待。

牛口蹄疫O型及亚洲Ⅰ型的血清学调查

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性高度接触性人兽共患传染病,其临床特征是在口腔黏膜、四肢下端及乳房等处皮肤形成水疱和烂斑。该病传播迅速,流行面广,主要侵犯偶蹄兽,成年动物多取良性经过,幼年动物多因心肌受损而死亡率较高。

犊牛O型-亚洲Ⅰ型口蹄疫母源抗体群体合格率衰减规律研究

牛被称为口蹄疫的“指示器”，在易感动物中最先感染口蹄疫的往往是牛，因此预防牛口蹄疫的发生对口蹄疫的防制具有重要意义。我国发生的牛口蹄疫主要为0型和亚洲I型，对牛口蹄疫最有效的预防和控制措施就是定期免疫接种口蹄疫疫苗。在疫防和控制措施就是定期免疫接种口蹄疫疫苗。在疫苗接种环节中，首免日龄的选择与母源抗体的衰减规律直接相关。

偶蹄动物免疫口蹄疫0型亚洲Ⅰ型二价疫苗后0型和亚洲Ⅰ型免疫抗体监测结果差异的原因分析

偶蹄动物免疫口蹄疫0型、亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗，监测口蹄疫0型、亚洲Ⅰ型免疫抗体滴度和合格率出现的差异，使兽医监测部门难以出具监测报告，镇动监所无法加强免疫，养殖户对疫苗质量和监测方法提出质疑。

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建

应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因,继而构建出真核表达载体pVAX-VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上,筛选出VP1表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子,获得转移载体。再经酶切,连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞,转染3次后,细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定,证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2/FMDV。经验证,该重组毒可稳定遗传,其毒价为103.5TCID50/mL。

O型口蹄疫泛亚毒株单克隆抗体的制备及抗原表位差异分析

用纯化的O型口蹄疫泛亚毒株免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经3次克隆和间接ELISA筛选,获得了ⅢA11、ⅢC3和ⅢF10 3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株.通过间接ELISA测定,单抗效价为:细胞培养上清1:160～1:640,腹水为1:5×104～1:4×105;经ELISA法测定,3株单克隆抗体均与泛亚株VP1蛋白反应,而不与A型口蹄疫病毒VP1蛋白反应;单抗的亚类鉴定结果表明,ⅢA11和ⅢF10分泌的抗体为IgG1亚类,ⅢC3分泌的抗体为IgG2b亚类.单克隆抗体抗原识别位点分析结果表明,ⅢA11与另外2种单克隆抗体的识别位点不同,而ⅢC3和ⅢF10的识别位点相近.

鉴别口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重RT-PCR检测方法的建立

为建立鉴别口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型的RT-PCR快速检测方法,根据GenBank中已登录的口蹄疫病毒(FMDV)O型、A型、AsiaⅠ型高度保守的2 B基因序列设计了1条共用反转录引物,根据3个血清型的VP1特异性基因序列,设计了3对型特异性引物对;以FMDV样本总RNA反转录产物为模板,建立了鉴别FMDV O、A、AsiaⅠ型三重RT-PCR检测方法。该方法灵敏度高,最低检测限均为100拷贝/μL;重复性和稳定性好;特异性强,与其他7个对照病原核酸均呈现阴性反应;可检测出10份疑似临床样品中3个血清型的FMDV感染样品。表明本试验成功建立了鉴别FMDV O型、A型、AsiaⅠ型三重RT-PCR检测方法,可用于临床上FMDV O型、A型、AsiaⅠ型的分型鉴别检测。