古细菌Pyrococcus furiosus高嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的分泌表达

该文将大肠杆菌表达载体pKK223-3中含tac启动子的片段以BamHI、EcoRI酶切后接入表达载体pET28a 中,构建成新的表达载体pEtac,通过PCR扩增获得P.furiosus 胞外α- 淀粉酶完整结构基因,接入pEtac 中,转化大肠杆菌JM109。在IPTG诱导下,转化子周质中能测出明显酶活,证明Pyrococcusfuriosus 的胞外α- 淀粉酶能在自身信号肽引导下分泌到大肠杆菌细胞周质中。重组酶最适pH为4.5,最适温度为95℃,重组酶经121℃保温1h,酶活仍能保持50%以上,性质与由P.furiosus自身分泌的胞外α- 淀粉酶相似。

古细菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从嗜热古细菌Pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶完整结构基因 ,插入表达载体pET2 8a中构建成质粒 pET amy(sig+) ,以质粒pET amy(sig +)为底物扩增出不含信号序列的α 淀粉酶成熟肽基因片断 ,获得质粒 pET amy(sig ) ,将重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。在T7启动子和lac操纵子控制下 ,通过IPTG的诱导在重组大肠杆菌细胞内分别表达出含信号肽和不含信号肽的融合蛋白。其中不含信号肽的融合蛋白具有与P .furio sus产生的胞外α 淀粉酶相似的酶学性质 :最适pH为 5 .0 ,最适温度约为 95℃ ,在 1 2 1℃下热处理 1h酶活仍能保持 50 %以上 ;

来源于嗜热古细菌Pyrococcus furiosus乳糖酶基因的原核表达及酶学性质分析

以嗜热古细菌Pyrococcus furiosus的基因组DNA为模板，通过PCR克隆获得乳糖酶基因celB。将celB基因插入到表达载体pET．30a（＋）上构建原核重组表达质粒pET-celB，转化大肠杆菌B121，阳性转化子在28％下经IPTG诱导4h后进行SDS．PAGE电泳和酶活性测定，结果表明celB基因在大肠杆菌中获得高效表达，乳“糖酶基因celB表达的乳糖酶蛋白CELB分子质量约为58kDa。CELB是耐高温酶，其酶促反应最适温度为105％，在95％至110％之间热稳定性较好；pH5．0时该乳糖酶水解活力最高，在pH5．0～10．0之间，pH稳定性较好，该酶对金属离子依赖性不强。

嗜盐古细菌的耐盐机制及其应用价值研究进展

嗜盐古细菌是一类主要生活在极性高盐环境中的古生菌。嗜盐古细菌及其酶具有耐高盐、耐极端pH和温度等特性,这使嗜盐古细菌来源的蛋白酶不仅成为各种生物技术产品的来源,还在生物技术中有许多潜在的应用。本文综述了嗜盐古细菌的分类、生理以及极性盐环境的适应机理,在盐环境下参与的代谢途径,进一步讨论了来源于嗜盐古细菌的各种活性蛋白酶的性质以及其在生产应用中扮演的重要角色。

古菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达

用PCR方法从嗜热古菌Pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶成熟肽结构基因 ,插入 pUC19中构建成质粒 pUC19 amy。将 pUC19 amy外源片段接入酿酒酵母表达载体 pYX2 12多克隆位点 ,构建成载体 pYX2 12 amy ,电转化酿酒酵母W 30 3 1A。转化子成功表达出有活性的高嗜热α 淀粉酶。重组酶具有与P furiosus产生的胞外α 淀粉酶相似的酶学性质 :最适 pH为 5 0 ,最适温度约为 90℃ ,在 12 1℃下热处理 30min酶活仍能保持 5 0

来源于Pyrococcus furiosus的耐高温α-淀粉酶基因在衣藻叶绿体中的表达

来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶是一种重要的酒精工业用酶,在植物中表达耐高温α-淀粉酶可以大大降低用植物秸秆生产酒精的成本。选择衣藻叶绿体基因组同源片段clpP-trnL-petB-chlL-rpl23-rpl2和壮观霉素抗性基因,构建了来源于Pyrococcusfuriosus的耐高温α-淀粉酶基因的衣藻叶绿体表达载体p64A。通过基因枪将其导入衣藻叶绿体中,经壮观霉素抗性(100mg/L)筛选,获得了9个抗性衣藻转化子。转化子经过抗性继代筛选后,经PCR、Southernblot检测分析及暗培养,证实耐高温α-淀粉酶基因已整合到衣藻叶绿体基因组中并得到表达。酶活性检测表明,转基因衣藻表达产物具有耐高温α-淀粉酶活性,每克鲜重衣藻最高达77.5u。实验结果证明在植物叶绿体中表达工业酶制剂是可行的。

南沙海区沉积物中细菌和古细菌16S rDNA多样性的研究

采用细菌 1 6SrDNA通用引物和PCR扩增等方法 ,构建了南海南沙海区沉积物 1 6SrDNA文库 ,并通过RFLP酶切分型对所获得的 70个克隆进行测序。从国际分子生物学数据库中调取相关序列 ,以PAUP4 0分析软件构建序列同源性矩阵和系统发育树图。结果表明 ,与细菌文库中克隆相似的微生物属于 4个细菌类群 :变形细菌 (Proteobacteria) (6 0 % )、革兰氏阳性细菌 (Gram positivebacteria) (1 3% )、浮霉菌 (Planctomycetes) (1 0 % )和无硫绿细菌 (Greennon sulfurbacteria) (6 % ) ,其中变形细菌 (包括δ 、γ 和α 变形细菌 )是明显的优势类群。采用Blast程序对所有序列基因数据库进行搜索 ,发现只有一个克隆与已知序列完全相似 ,说明文库具有极高的多样性。但是对古细菌文库中所获得的克隆子进行二级结构和序列特征分析的结果表明 ,这些克隆子均为海洋未获培养的细菌 。

垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落16S rRNA基因的ARDRA分析

利用特异性的引物对 ,选择性扩增垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落的 1 6 S r RNA基因片断 ,在此基础上建立 1 6 Sr DNA克隆文库。经古细菌通用寡核苷酸探针的原位杂交筛选后 ,克隆文库内古细菌 1 6 S r DNA扩增片断的多样性通过ARDRA分析 ( amplified r DNA restriction analysis)而获得。利用 PCR将各重组克隆子内的 1 6 S r DNA外源片断再扩增出来后 ,两种限制性内切酶 -H ha 和 H ae -被分别用于 1 6 Sr DNA克隆片断的限制酶切分析。结果表明 ,随机选出的 70个古细菌 1 6 S r DNA克隆片断被分为 2 1个不同的 ARDRA型 (组 ) ,其中的两个优势型总共占了所有被分析克隆子的6 0 % ,而其余 1 9个型的相对丰度均处于较低的水平 ,当中的 1 4个型更仅含有 1个克隆子。通过对 1 6 Sr RNA基因的 PCR扩增、克隆及其 ARDRA分析 。

“传统”垃圾填埋场渗滤液中古细菌16S rRNA基因的RFLP分析

“传统”垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落的多样性通过不依赖于培养的分析而获得。将渗滤液中古细菌的16S rRNA基因片断(16S rDNA)选择性地扩增出来并用于构建16S rDNA克隆文库。文库内古细菌16S rDNA的遗传变异性通过RFLP分析(限制性内切酶Hha Ⅰ和HaeⅢ)而得到。80个随机选出的古细菌rDNA克隆子被划分为29个不同的RFLP型(组),其中最大的5个型共占所有被分析克隆子的53％左右,而其余24个型的丰度均处于相对较低的水平,其中16个型更仅含有1个克隆子。有关结果表明,对克隆16S rDNA片断的RFLP分析是评估复杂厌氧系统中微生物群落多样性的有力工具。

极端嗜热菌Pyrococcus furiosus热休克蛋白HSP60的克隆表达和纯化

[目的]研究极端嗜热菌Pyrococcus furiosus的热休克蛋白HSP60(Pfu-HSP60)的克隆表达与纯化方法。[方法]应用加拿大HSP60数据库及其BLAST和FASTA序列比较工具对Pfu-HSP60基因序列进行同源性分析,对HSP60基因进行了体外扩增并在大肠杆菌中成功克隆与表达,还进行了Pfu-HSP60蛋白的纯化。[结果]以Taq酶为DNA聚合酶,用PCR方法扩增出预期的Pfu-HSP60基因,插入质粒pET-21a,转化入大肠杆菌受体菌BL21-Codonplus(DE)3-RIL,0.1mmol/LIPTG诱导2 h,得到可溶性高表达,经超声、离心、上清85℃加热、再离心得到初步纯化的Pfu-HSP60蛋白,再经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化,收集峰超滤浓缩后经SephacrylS-200凝胶过滤柱,收集Pfu-HSP60蛋白峰,结果获得纯度为94.5%以上的重组Pfu-HSP60蛋白,总得率为28.0%。[结论]该研究为Pfu-HSP60蛋白的结构和功能及其他热休克蛋白相互作用机制等的研究奠定基础。

牙周治疗对龈下菌斑中古细菌定植的影响

目的研究牙周治疗对龈下菌斑中古细菌定植的影响。方法对49例中重度牙周炎患者的牙周治疗进程进行跟踪,分别于龈上菌斑刮除后(基线)、牙周基础治疗后4周和牙周翻瓣术后12周,采集龈下菌斑标本抽提DNA,利用古细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR,对各菌斑标本古细菌16S rRNA表达进行定性检测,确定阳性标本并计算古细菌检出率。采用Real-Tim e PCR技术对阳性标本中总细菌和古细菌16S rRNA基因进行定量检测,计算古细菌相对丰度。结果牙周翻瓣术后12周时龈下菌斑标本中的古细菌检出率和古细菌相对丰度分别为17.6%和0.58%,显著低于基线时的69.4%和2.32%及牙周基础治疗后4周时的57.1%和2.30%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论龈下菌斑中古细菌的定植情况伴随牙周治疗的进程而迅速降低,提示菌斑厌氧环境的改变是影响古细菌定植的关键因素。

河南鲁山五大温泉古细菌多样性分析

河南省平顶山市鲁山县有上汤、中汤、下汤、温汤和碱汤等五大温泉,采用Illumina Hisiq2500PE250技术对鲁山五大温泉(上汤、中汤、下汤、温汤和碱汤)古细菌的16S r DNA基因V4-5变异区序列进行测序,应用Uparse、Mothur、SILVA、MUSCLE和Qiime等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)数量,分析物种的丰度和多样性.上汤、中汤、温汤、下汤和碱汤分别获得87 993、67 326、44400、48 611、48 495条有效reads,聚类为520、280、678、451、437个OUTs.古细菌分类分析表明,河南鲁山五大温泉的古细菌可以归入11个门,其中奇古菌门(Thaumarchaeota)占95.25%,是优势菌群;在属分类阶元上,上汤、中汤和温汤的优势菌属为Candidatus-Nitrosocaldus; unidentified-Thaumarchaeota是下汤和碱汤的优势菌属.对河南鲁山五大温泉开展古细菌多样性的研究发现,温泉水中含有较高的参与氨氧化过程的奇古菌门,为后续深入研究和利用河南鲁山五大温泉水中的古细菌资源提供了基础资料.

牙周病患者龈下菌斑中古细菌的分布

目的建立牙周袋龈下菌斑中古细菌分布的基线信息,探讨其分布与牙周病发生的关系。方法运用古细菌通用引物扩增菌斑标本,PCR产物连接TA载体,挑选多个克隆测序。其结果使用数据库比对并构建系统发育树分析。随机采集牙周病患者龈下菌斑标本,按照牙周袋深度分组(A、B、C、D组),检测并比较各组菌斑中古细菌的检出率。结果测序结果证实扩增产物为古细菌。临床标本中牙周袋较深组(C组和D组)的古细菌检出率显著高于浅牙周袋组(A组和B组)。结论古细菌的检出率随牙周袋探诊深度的增加而增高。提示古细菌可能参与牙周病的发病。

嗜盐古细菌的系统发育分析

用“Clustalw”和“PHYLIP”程序包分析嗜盐古细菌16S rRNA序列,建立了嗜盐古细菌的系统发育树。比较分析的结果进一步支持了以前的结论,即嗜盐古细菌在自然系统分类上应被分成嗜盐菌科的6个属。此系统发育分析方法不仅体现了在嗜盐古细菌属一级分类上的优势,而且还可能被用作一种相应于以《伯杰氏细菌系统分类手册》(第三卷)为基础的嗜盐古细菌种一级分类上的代换方法。实际上,这种系统发育分析方法比其他建立在表型特性基础上的分类系统更真实地反映了嗜盐古细菌内的亲缘关系。该方法的其他运算细节在本文中也进行了讨论。

青岛东风盐场中极端嗜盐古细菌的特性

从青岛东风盐场分离到3株嗜盐古细菌（编号：ZDA－1，ZDA－2和ZDA－5），细胞为多形态杆状（0．7～15μm×2．0～50μm），最适生长NaCl浓度为3．4mol／L，含有甘油二醚脂，类胡萝卜素色素和极性脂TGD－2（三糖基二醚脂），x（C＋C）分别为63．7％，62．7％，和64．3％，据此，这3株菌可归入嗜盐小盒苗属（Hchoarcula）；但它们不水解淀粉，明胶不液化，不水解酪蛋白等生理生化特性不同于该属中现已正式承认的两个种，因此，本工作分离的3株菌可能是嗜盐小盒菌属一个新种.

耐热嗜酸古细菌谷氨酰胺合成酶基因的克隆、诱导表达和活性测定

采用DEAE Sepharose及SephacrylS 30 0柱分离纯化了耐热嗜酸古细菌Sulfolobusacidocaldarius谷氨酰胺合成酶 (E 6 .3.1.2 ,Sac GS) .SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分子质量为 5 3ku的单一条带 .测定其N端氨基酸序列为PGLPKNEHEALEFLKSNNIKWVDLQ ,与其他古细菌谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列进行比较后 ,发现均存在ATP结合保守序列TFMPKP (I/L/F) (F/P/Y) (G/R) .采用碱基的简并性设计出一对简并引物 ,以Sulfolobusacidocaldarius的基因组DNA为模板进行PCR扩增 ,获得 780bp的DNA片段 ,经克隆测序后确定为谷氨酰胺合成酶基因片段 ,以地高辛标记的该片段为探针 ,将Sulfolobusacidocaldarius基因组DNA用不同的限制性内切酶分别进行单双酶组合切割 ,然后进行DNA印迹分析 ,选出了 2 4kb的BamHⅠ /HindⅢ双酶切片段 ,并克隆到pBluescriptKS+ 质粒中 ,通过菌落原位杂交获得阳性克隆 ,进行DNA全序列测定后 ,得到完整的1 5kb的谷氨酰胺合成酶全基因序列 ,再将其克隆到 pET3c载体中 ,在大肠杆菌BL2 1中进行诱导表达并进行相应的活性测定 ,其酶活力的最适温度为 90℃ .

古细菌Aeropyrum pernix K1超嗜热酯酶APE1547的稳定性

研究了纯化的超嗜热酯酶APE1547的稳定性．结果表明，该酶的稳定性非常好，蛋白的质量浓度为0．4mg／mL时，90℃的半衰期为20h，0．2mg／mL时的半衰期为12h；而蛋白的质量浓度为0．04mg／mL时，保温2．5h时残余活力仍在50％以上．同时还研究了热变性时该酶表面疏水氨基酸的变化．该酶的pH稳定性也很好，pH在6．5～9．0范围内作用24h，酶依然很稳定，残余酶活力大于93％；同时该酶还具有很强的耐有机溶剂的特性．

降解2，4-二氯酚的厌氧颗粒污泥-悬浮载体生物膜反应器中古细菌的种群结构

采用古细菌特异性引物ARC21F/ARC958R对污泥样品的总DNA进行聚合酶链式反应(PCR)、克隆、序列分析等,研究了降解2,4-二氯酚(2,4-dichloropheno,l2,4-DCP)的厌氧颗粒污泥-悬浮载体生物膜反应器(Anaerobic granu-lar sludge-suspended carrier biofilm reactor,ASBR)中古细菌的种群分布.结果表明,接种污泥和ASBR各层污泥中存在共有的古细菌:Methanothrix soehngenii和Uncultured archaeon等,M.soehngenii、uncultured archaeonTA05和unculturedarchaeon TA04在接种污泥和ASBR各层污泥中的分布为:接种污泥的丰度<上层的丰度<中层的丰度<下层的丰度.uncultured archaeon44A-1、uncultured archaeon39-2、uncultured archaeon46-1和uncultured archaeon69-1的分布为:接种污泥的丰度>上层的丰度>中层的丰度>下层的丰度.经2,4-DCP驯化后,ASBR上层悬浮填料区出现特有的古细菌unidentified crenarchaeote等,下层厌氧颗粒污泥区特有的古细菌为uncultured archaeon ZAR106等.接种污泥特有的6种古细菌Methanosaeta concilii等经2,4-DCP驯化后消亡,污泥中古细菌多样性减少,以下层颗粒污泥中古细菌种群丰度的变化最为明显.

采油废水缺氧处理体系细菌和古细菌丰度对比

建立缺氧的模拟生物处理体系经过物化预处理的采油废水,利用荧光原位杂交技术(FISH)跟踪了废水处理系统启动和稳定过程中真细菌和古细菌相对丰度的变化.结果表明,系统稳定后的COD去除率在40%左右.细菌和古细菌在采油废水生物处理系统中都有很高的比例,并呈现不同的变化趋势.细菌丰度在启动和稳定后维持在15%左右;而古细菌在系统稳定过程中呈现逐渐增加的趋势,比例上升到21%.表明古细菌可以在活性污泥系统中稳定存在并发挥作用,说明古细菌在特定污水处理上具有一定的研究和应用价值.

产甲烷的常温古细菌和嗜热古细菌的代谢网络比对研究

生物网络比对是生物体的结构、功能和进化分析的重要研究手段.以从KEGG数据库获得的产甲烷的常温古细菌Methanosarcina acetivorans(M.acetivorans)和嗜热古细菌M ethanopyrus kandleri(M.kandleri)的代谢网络为对象,采用了网络比对算法M atching-based Integrative GRAph Aligner(M I-GRAAL)对它们的全局代谢网络以及hub模块网络进行了比对.比对结果表明采用度、聚集系数以及离心率三个度量参数相结合的网络比对结果明显优于其它度量参数的计算结果,且结果更稳定.同时发现常温产甲烷菌M.acetivorans的hub模块与嗜热产甲烷菌M.kandleri的hub模块相似代谢途径的拓扑基本一致,不相似的代谢网络中有81.8%以上的节点都在嗜热产甲烷菌M.kandleri的最紧密的7-核中,推测嗜热菌的耐热性可能与受到胞内酪氨酸的影响.