慢性B淋巴细胞白血病患者免疫球蛋白Fab段基因克隆及其可变区序列分析

目的 分析慢性B淋巴细胞白血病患者外周血单个核细胞免疫球蛋白Fab段基因。方法 提取慢性B淋巴细胞白血病患者外周血单个核细胞RNA ,选用与IgFR15′和CH1Cμ 3′或CL区(Cκ/Cλ) 3′互补的多对引物 ,通过RT PCR扩增IgFab段基因 ,进行克隆和序列测定 ,并通过DNAtools和计算机网络对其可变区基因同源性进行分析和基因家族归类。结果 7例患者中 4例外周血单个核细胞扩增出轻链基因 ,3例扩增出重链基因。所扩增的 4条轻链基因均属于κ轻链 ,3条重链均为 μ链基因。利用DNAtools分析软件 ,对轻链和重链分别进行同源性比较 ,3条重链可变区基因差异较大 ,轻链可变区基因具有一定的同源性。对所扩增的Ig基因进行归类 ,结果 4例患者的轻链均属于VκI亚组 ;3例患者的重链中 2例属VH3家族 ,1例为VH5家族。

β淀粉样肽单克隆抗体可变区基因的5′RACE扩增及序列分析

目的:克隆并分析抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因。方法:从分泌抗β淀粉样肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株A8中提取总RNA,根据恒定区序列设计基因特异性引物,通过5′RACE法扩增抗体的轻链和重链可变区基因,测定并分析可变区基因序列,并克隆入pMD18-T载体。结果:重链可变区基因序列全长450bp,编码150个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长429bp,编码143个氨基酸残基。在GeneBank中对氨基酸序列进行比对分析,二者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。根据Kabat法则对A8抗体轻链和重链可变区氨基酸序列基因进行分析并确定了3个抗原互补决定区(CDR)、4个框架区(FR)和信号肽。结论:通过5′RACE法得到了抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构,以及对该抗体进行人源化改造奠定了基础。

抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体可变区基因的5'RACE扩增及序列分析

目的:克隆并分析抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体轻链和重链的可变区基因。方法:从分泌抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取总RNA,根据小鼠IgG恒定区序列设计特异性引物,通过5′RACE法扩增其轻链和重链的可变区基因,克隆入pMD18-T载体,测序并分析其可变区序列。结果:3株抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的重链可变区基因序列全长均为423 bp,编码141个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长均为393 bp,编码131个氨基酸残基;在GenBank中对氨基酸序列进行比对分析,均符合小鼠IgG可变区基因的特征;根据Kabat法则对3株抗体轻链和重链可变区氨基酸序列进行分析,确定了3个抗原互补决定区、4个框架区和前导肽。结论:通过5'RACE法得到了3株抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构、人源化改造奠定了基础。

抗噻虫嗪重组全长抗体的制备与特异性识别机制研究

本研究旨在制备抗噻虫嗪的重组抗体,并采用计算机辅助的同源建模和分子对接的方法解析抗体和噻虫嗪的特异性分子识别机制。首先,采用表面等离子共振技术评价了抗噻虫嗪单克隆抗体的识别性能;其次,以抗噻虫嗪杂交瘤细胞株为基因来源,经分子克隆获得了抗体可变区序列,由哺乳动物细胞HEK 293(F)体外表达成功获得了全长重组抗体;最后,基于正确的可变区序列,采用同源建模和分子对接手段,研究了抗体高亲和力特异结合噻虫嗪的分子识别机制。结果表明,抗噻虫嗪单克隆抗体可特异性识别噻虫嗪,且与其具有较高的结合亲和力(解离平衡常数KD=7.995×10^(-11) mol/L)。由HEK 293(F)体外表达的全长重组抗体,采用间接竞争酶联免疫吸附分析方法进行评价,表明该重组全长抗体对噻虫嗪的IC_(50)值为0.41μg/L,与其他新烟碱类农药的交叉反应率<0.04%,表现出与亲本单克隆抗体一致的性能,即具有高特异性、高灵敏度的识别活性。分子对接计算结果表明,位于疏水结合口袋参与形成范德华力的8个氨基酸残基和参与形成氢键的Asn39(L-CDR1)残基与抗体的选择性(特异性)相关,位于重链CDR区的两个氨基酸His35(H-CDR1)和Trp108(H-CDR3)残基决定了抗体对噻虫嗪的结合亲和力。该研究制备的重组全长抗体可代替传统单克隆抗体建立多种免疫检测方法,应用于环境样品和农产品中噻虫嗪的残留检测。解析的噻虫嗪抗原抗体分子识别机制,可为后续改造更高亲和力的抗体提供理论依据。