HIV诱使特异性T细胞受体可变基因产物减少

HIV感染伴有CD4T细胞数量缺失的原因,目前尚不清楚。近来一些报道指出,同种免疫机制和超抗原活化是HIV感染T细胞缺失的一个重要原因。这两种机制可诱发T细胞功能麻痹,从而引起细胞免疫损害。 文章对13例健康男性异性恋者（heal-thyheferosxcual males,HHem）,9例HIV血清阴性男性同性恋者（HIV-sero-negative homosexual males。

非小细胞肺癌中可变剪切基因及其作用的研究进展

肺癌是严重威胁我国居民健康的主要公共卫生问题之一。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常见的组织学类型,占所有肺癌的80%~85%。但NSCLC的发病机制仍不完全清楚。可变剪切是指一个mRNA前体通过不同的剪接方式(选择不同的剪接位点)产生不同mRNA剪接异构体的过程。可变剪切是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制,可变剪切基因异常几乎与肿瘤细胞的所有特征表型有关,能够参与多种肿瘤的发生、发展以及治疗耐药。在NSCLC中的可变剪切基因主要有MET、GLDC、RBM、Bcl-xL、SRSF、ADD3等,这些可变剪切基因能够参与NSCLC细胞的增殖、分化、凋亡等一系列生物学行为。因此,深入探索可变剪切基因,或可为NSCLC诊断和治疗提供新的思路。

抗HFRS病毒McAb 1A8可变区基因的克隆及序列分析

抗ＨＦＲＳ病毒ＭｃＡｂ１Ａ８可变区基因的克隆及序列分析阎岩徐志凯姜绍谆尹文吴兴安王海涛薛小平（第四军医大学微生物学教研室，西安７１００３２）基因工程小分子抗体由于分子小，免疫原性弱，穿透力强，易于抵达抗原“峡谷”位点，因此对于研究病毒及肿瘤分子的结构...

抗人肺腺癌单克隆抗体重、轻链可变区基因的分离克隆和序列测定

根据鼠免疫球蛋白重。轻链可变区基因ＦＲ１和ＦＲ４的序列保守性，化学合成了适于体外扩增Ｉｇ重、轻链可变区基因（Ｖ_Ｈ和Ｖ_Ｌ）的数对引物。以分泌抗人肺腺癌单抗的杂交瘤细胞株ＷＬＡ－２Ｃ４的基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增Ｖ_Ｈ和Ｖ_Ｌ基因，分别克隆人ｐＵＣ１９载体。转化子经蓝、白斑筛选，酶切鉴定，双脱氧测序证实确为鼠单抗可变区基因，其中Ｖ_Ｈ基因全长为３４８ｂｐ，编码１１６ａａ，属重链ⅡＢ亚类；Ｖ_Ｌ基因全长３１８ｂｐ，编码１０６ａａ，属Ｋ轻链Ⅵ亚类。

抗人CD16单克隆抗体可变区基因的克隆和表达

目的 克隆抗人CD16单克隆抗体重、轻链可变区（VH,VL）基因并合成单链抗体（ScFv）基因。方法 从分泌抗人CD16单克隆抗体的杂交瘤细胞B88-9中提取总RNA,应用RT-PCR技术获得抗CD16单克隆抗体的VH、VL基因。用连接肽（Linker）将VH和VL连接成具有VH-Linker-VL结构的ScFv基因,将其克隆到表达载体pcDNA3.1（+）,并转染COS-7细胞。结果VH基因长度为354bp,属于鼠抗体可变区重链基因家族I（B）亚群;VL基因长度为333bp,属于鼠抗体可变区 kappa轻链基因家族Ⅲ亚群。采用夹心ELISA方法检测到ScFv的表达。结论 抗人CD16单克隆抗体VH与VL基因的克隆和ScFv基因的构建为基于CD16的导向免疫治疗奠定了基础。

抗CEA抗体可变区基因的克隆及其嵌合抗体的表达

目的 在真核细胞中表达抗癌胚抗原 (carcinoembryonic antigen,CEA)人 -鼠嵌合抗体。方法 从分泌抗 CEA鼠单抗 C5 0的杂交瘤细胞中扩增、克隆可变区基因。测序鉴定后连入真核表达载体 ,导入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢 (dihydrofolate reductase- deficient Chinese ham ster ovary,CHO- dhfr- )细胞进行表达。采用间接和竞争抑制 EL ISA检测表达产物的人源性和抗原结合特异性。结果 序列测定初步确定所克隆的是功能性抗体可变区基因。在转染细胞上清中测到抗 CEA嵌合抗体的表达。EL ISA试验证实该嵌合抗体具有人的恒定区 ,并与原鼠单抗 C5 0有相同的抗原结合特异性。结论 成功地在真核细胞中表达了抗 CEA人 -鼠嵌合抗体。

抗重组人bFGF单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的构建和表达

目的:从分泌抗重组人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株B2F3中克隆抗体可变区(V)基因,构建bFGF单链抗体(scFv),并进行可溶性表达。方法:从分泌bFGF mAb杂交瘤细胞株B2F3提取总RNA,用RT-PCR方法扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链的可变区基因(VL);再通过重叠延伸拼接(SOE)PCR方法,在VH和VL基因之间引入linker(Gly4Ser)3,构建bFGFscFv。将测序正确的scFv基因克隆到表达载体pCANTAB5E中,选择非抑制型菌株E.coli HB2151进行可溶性表达;经SDS-PAGE检测抗体表达水平,ELISA鉴定其抗原结合活性。结果:测序分析结果显示,VH基因序列全长375碱基对,编码125个氨基酸,VL基因序列全长399碱基对,编码133个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FR)、3个抗原互补决定区(CDR)及抗体特征性的2个半胱氨酸残基;构建的scFv全长789碱基对,编码263个氨基酸,连接结构为VH-linker-VL。SDS-PAGE分析表明scFv基因在大肠杆菌为可溶性表达,表达产物主要位于周质腔中,表达产物的Mr为27000,与理论预期值相符;间接ELISA检测结果显示原核表达的scFv具有与bFGF特异性结合的活性。结论:成功地克隆bFGF mAb可变区基因,并构建表达bFGF scFv,为下一步研究bFGF抗体人源化改造奠定实验基础。

hTNF-α单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列及分子结构分析

从两株具有高亲和力及中和活性的抗人肿瘤坏死因子－α（ｈＴＮＦ－α）的单抗杂交瘤细胞株１Ｃ３、３Ｆ６中分别提取总ＲＮＡ，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆了抗体的ＶＬ、ＶＨ基因。核苷酸序列分析表明，所克隆基因均为抗体的ＶＬ、ＶＨ基因，并分别属于Ｋａｐｐａ链Ⅳ亚组和重链Ⅲ（Ｄ）亚组。此外，两抗体可变区分子模型及与ｈＴＮＦ－α的结合模型的建立及分析，为进一步的基因工程抗体研究及抗原－抗体相互作用机理的研究奠定了基础。

抗新城疫病毒HN蛋白单抗可变区基因的克隆与序列分析

提取抗新城疫HN蛋白单克隆抗体C3-B7杂交瘤细胞总RNA,进行RT-PCR,扩增出轻重链可变区基因。凝胶回收纯化后与pMD-18T载体连接,重组载体转化于宿主菌DH5α,筛选出阳性重组子,菌液PCR鉴定后进行测序。结果显示,VH基因全长357 bp,编码119个氨基酸;VL基因全长332 bp,编码110个氨基酸。这为单链抗体的构建及表达奠定了基础。

抗人CD3单抗轻、重链可变区基因的克隆及序列分析

根据抗体基因可变区两端保守序列ＦＲ１和ＦＲ４，设计并化学合成轻重链ＰＣＲ扩增引物。从体外培养细胞ＵＣＨＴ１中提取总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ，以ｃＤＮＡ为模板经ＰＣＲ扩增轻，重链可变区基因片段。将扩增片段克隆至ｐＵＣ１９质粒，筛选阳性克隆并测序，序列分析结果为重链３６６ｐｂ，编码１２２个氨基酸，轻链３２７ｂｐ。

具有GPX活性的单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的利用分泌具有GPX活性的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞3G5,克隆其mAb体的可变区基因。方法提取杂交瘤细胞的总RNA ,分离mRNA ,反转录合成cDNA。经PCR扩增VH 基因和VL 基因 ,将VH 基因和VL基因与载体 pGEM T连接后 ,进行酶切鉴定和序列分析。结果构建了2个分别含有VH 和VL 基因的重组质粒。序列分析表明 ,VH 和VL 分别属于mouscheavychainsubgroupIII和mouselightchainsubgroupV亚群 ,长度为372和324bp ,编码124和108个氨基酸 ,在高变区分别有4和2个丝氨酸。结论克隆的VH 和VL 基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征 ,为将来制备具有GPX活性的单链抗体提供了可靠的基因材料。

抗乙型脑炎病毒单抗重链可变区基因的筛选和鉴别

为了制备抗乙型脑炎病毒的人-鼠嵌合抗体,以分泌抗乙型脑炎病毒单抗的51-8杂交瘤细胞株为材料,分离这一单抗的重链可变区基因。杂交瘤细胞的大分子量DNA经Bam HI部分酶切后,以λEMBL-3为载体,构建了总数为2×10~7pfu的基因文库。以抗乙脑病毒单抗重链可变区cDNA为探针,从360000个噬菌斑中筛选出9个阳性斑,经点杂交及Southern杂交证明它们都含有重链可变区基因的片段。进一步以J_(11)探针(含J_3、J_4和重链增强子)对其中4个重组体进行鉴别。经EcoRI酶切后,有3个重组体含有与肝细胞和Sp2/0细胞相同的3.8kb片段,而第4个重组体(λ8a4)没有这一片段,却有一个4.5kb片段,这是在肝细胞和Sp2/0细胞中不存在的。从而证明前3个重组体的插入片段是未经重排的重链可变区基因片段,而λ8a4中的插入片段含有经过重排的功能性可变区基因。这一4.5kb片段不能与含有J_1—J_2的探针杂交,却同时含有V_H、J,或/和J_4和增强子。进一步证明,这是一个功能性的可变区基因。因此,将这一4.5kb片段分离出来之后,在pUC19中亚克隆并作酶切图。为构建抗乙脑病毒的人-鼠嵌合重链基因奠定了基础。

抗人肝癌单克隆抗体重链可变区基因克隆和序列测定

应用反转录ＰＣＲ方法从分泌抗人肝癌单克隆抗体鼠杂交瘤细胞系ＨＡｂ２７中成功地克隆了单抗重链可变区基因，将此基因重组入Ｍ１３噬菌体中，双脱氧链终止法测定了核苷酸序列。经计算机分析，基因全长４０８ｂｐ，编码１３６个氨基酸，并进行了基因同源性分析。结果表明获得的重链可变区基因是具有功能性的，两端引物自带起始码和终止码，可直接插入原核载体中进行表达。

抗血管内皮生长因子165抗体轻重链可变区基因的克隆与序列分析

目的 获得抗血管内皮生长因子 1 6 5 ( VEGF1 65)抗体的轻重链可变区基因。 方法 从分泌具有中和抗血管内皮生长因子 1 6 5活性的单抗杂交瘤细胞株Vm D1 1中提取总 RNA,经 RT- PCR扩增并克隆该单抗的轻、重链可变区基因并进行序列分析。结果 抗体的轻链可变区基因 32 1 bp,属于小鼠第 亚群 ;重链可变区基因 35 4bp,属于小鼠第 ( B)亚群。结论 所克隆的基因经核苷酸序列分析分别为抗体的轻、重链可变区基因。

小鼠BMP-McAb可变区基因的体外扩增、克隆与序列分析

从体外培养的ＢＭＰＭｃＡｂ杂交瘤中提取细胞总ＲＮＡ，反转录成ｃＤＮＡ。以ｃＤＮＡ为模板，利用两对根据免疫球蛋白重链与轻链可变区５′端序列和Ｊ区序列设计合成的引物，通过ＰＣＲ方法，扩增出抗体重链、轻链可变区基因片段（ＶＨ，ＶＬ）。将扩增产物分别克隆入ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９质粒，筛选出阳性克隆，利用双脱氧链终止法进行序列测定，经计算机分析，ＶＨ基因全长为３４５ｂｐ，编码１１５个氨基酸；ＶＬ基因全长为３１５ｂｐ，编码１０５个氨基酸。

CD25抗体轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

目的 获得抗人ＣＤ２５分子单抗的轻链及重链可变区基因，并进行序列分析。方法 采用ＲＴ－ ＰＣＲ，从ＷｕＴａｃ细胞总ＲＮＡ中扩增出轻链、重链可变区基因，进行克隆并作核苷酸序列分析。结果 构建的ＰＭＤ１８ －Ｔ－ＶＬ和ＰＭＤ１８－Ｔ－ＶＨ重组克隆载体，酶切与预期结果相符。ＶＨ和ＶＬ基因序列与鼠抗体的同源性大于 ８０％。克隆的重链可变区基因长度为３５１ｂｐ，属于鼠重链Ⅲ（Ｃ）亚类。轻链可变区基因长度为３２４ｂｐ，属于鼠轻链 Ⅳ 亚类。结论 本研究采用ＲＴ－ＰＣＴ法扩增出轻链及重链可变区基因，并进行了序列测定和分析，为进一步构建嵌 合抗体以及单链抗体奠定了基础。

抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析

目的 克隆和分析抗汉滩病毒单克隆抗体 (McAb)H7可变区基因。方法 根据鼠源抗体可变区 (V)氨基酸序列 ,设计合成一组抗体重、轻链可变区 (VH/VK)简并引物。采用一步法提取McAbH7细胞总RNA ,通过RT-PCR扩增V基因 ,并进行核苷酸序列测定和分析。结果 通过RT -PCR成功克隆了H7可变区重轻链基因 ,序列分析表明均为开放阅读框 ,符合小鼠抗体框架结构 ,含有明确的 4个骨架区和 3个抗原决定簇互补区 ,与抗体二硫键形成有关的两个特征性半胱氨酸亦高度保守。同源对比表明 ,H 7-VK长 3 57bp ,编码 119个氨基酸 ,属JK4重排 ;H 7-VH长 3 60bp ,编码 12 0个氨基酸 ,属JH4重排。经GenBank查询证实为新基因 ,登记号为AY 2 4560 1和AY2 4560 2。结论 McAbH7可变区基因的获得 。

日本血吸虫单克隆抗抗独特型抗体NP48可变区基因的克隆及序列分析

目的 克隆日本血吸虫单克隆 anti- anti- id NP4 8轻链及重链可变区基因并分析其序列。方法 从杂交瘤细胞 NP4 8提取总 RNA、RT- PCR扩增目的基因片段 ,分别克隆于 p MD18- T载体 ,测序并作核苷酸序列分析。结果 VL 基因全长 336 bp,属鼠免疫球蛋白κ链第 亚类 ,由种系基因he2 4与 Jκ4 重排而来。该 VL基因序列已被 Gene Bank收录 (accession No.AY 30 90 10 )。 VH 基因全长35 4 bp,属鼠免疫球蛋白重链第 亚类 ,由种系 J5 5 8.4 7、Dsp2 .2和 JH4 基因重排而来。该 VH 基因序列已被 Gene Bank收录 (accession No.AY312 4 33)。结论 序列比对分析表明该 VL、VH基因为日本血吸虫单克隆 anti- anti- id NP4 8可变区基因。

抗口蹄疫病毒单克隆抗体1C7重轻链可变区基因的克隆及序列分析

应用分子生物学技术 ,从分泌抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞 1C7中提取总RNA ,经反转录 ,PCR扩增及克隆 ,分别得到VH 基因及VL 基因。序列测定结果表明 :1C7的VH 基因为 36 8bp ,VL 基因为 32 3bp。用NCBIGenBank分析表明 ,VH 和VL 均符合小鼠抗体可变区特征 ,为功能性重排的抗体可变区基因。根据Kabat分类体系 ,1C7的VH 基因中的VH基因片段隶属于抗体重链第 7183家族 ,其VL 基因中的VL基因片段隶属于抗体K轻链 2 0家族 ,VH 基因由VH76_1BG_DFL16 .1_JH4重排而形成 ,VL 基因由VKbw2 0_JK2重排而形成。 1C7的VH 和VL

鼠抗CD71单抗轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

目的 获得鼠抗人CD71分子单抗的轻链及重链可变区基因。方法 用一步法提取总RNA,逆转录形成cDNA,设计并合成一套扩增小鼠重、轻链可变区的通用引物,通过PCR扩增基因．分别克隆人pMD18－T载体中,作核苷酸序列分析。结果用重链引物扩增获得长约350bp的片段,用轻链引物扩增获得长约330bp的片段,序列测定获得它们的DNA序列。结论克隆的重链可变区基因长度为348bp,属于小鼠H链可变区IA亚组;克隆的轻链可变区基因长度为336bp,属于小鼠K轻链可变区Ⅱ亚组。