多位点可变数量串联重复序列分析在北京家族结核分枝杆菌基因分型中的应用及位点筛选

目的对于北京家族菌株占绝大多数的感染人群,评价多位点可变数量串联重复序列(variable number tandem repeats,VNTR)分析(multiple loci VNTR analysis,MLVA)中不同位点组合在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)基因分型研究中的应用。并以IS6110限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)为参照,筛选有效位点。方法分别采用IS6110-RFLP、间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及MLVA不同位点组合对北京海淀区收集的MTB临床分离株进行基因分型研究,比较3种方法及MLVA不同位点组合的分型效果。结果 45株MTB分离株中86.7%为北京家族菌株,Spoligotyping和结核分枝杆菌散在分布重复单位(mycobacterial interpersed repetitive units,MIRU)-12系列的HGI(Hunter-Gaston Index)值分别为0.4313和0.8700,将45株MTB菌株分为10个和23个基因型。VNTR-9系列和IS6110-RFLP的分型结果一致,HGI值较高,为0.9980,将45株MTB菌株分为43个基因型。结论北京家族结核分枝杆菌在北京海淀区呈高水平流行。对于北京地区北京家族菌株占绝大多数的感染人群,VNTR-9系列MLVA是较为简便和高分辨率的分型方法 ,其分辨率能够达到MTB基因分型"金标准"IS6110-RFLP水平。

沈阳市2012—2021年食源性致病菌监测蜡样芽孢杆菌多位点可变数量串联重复序列的分型分析

目的利用多位点可变数量串联重复序列分型(MLVA)技术,对沈阳市在各类食品检出的蜡样芽孢杆菌进行分子分型,为预防预警食物中毒提供技术支持。方法采集2012—2021年沈阳市食源监测样品中蜡样芽孢杆菌阳性菌株61株,利用PCR方法,结合毛细管电泳,对样品选择Bcms-08、Bcms-17、Bcms-18、Bcms-19、Bcms-20共5个位点进行蜡样芽孢杆菌MLVA分子分型。结果61株的蜡样芽孢杆菌有24个基因分型,共分为3个聚类群,其中食物来源相同的菌株基因分型基本一致,但相同食物来源的菌株又处在不同聚类群的基因分型中。结论蜡样芽孢杆菌MLVA分型呈较好的多态性,大部分菌株亲缘关系较近,相似度较高,无明显的聚集性。由于研究中缺少食物中毒爆发菌株及食品外环境分离株,样本数量有限,所以对致病菌的基因分布尚有局限性。

间隔区寡核苷酸分型和多位点可变数量串联重复序列分析在结核分枝杆菌基因分型中的应用

目的评价间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）及多位点可变数量串联重复序列分析（MLVA）方法在结核分枝杆菌基因分型研究中的应用。方法收集224株结核分枝杆菌临床分离株，分别采用Spoligotyping及MLVA方法进行基因分型，比较两种方法的分型效果，评价两种方法在结核分枝杆菌基因分型中的应用。结果使用Spoligotyping方法，224株结核分枝杆菌呈现出55种基因型，39株具有独特的基因型，其余185株菌呈现出16种基因型；使用MLVA方法时，224株结核分枝杆菌呈现出160种基因型，132株具有独特的基因型，余下的92株菌呈现出28种基因型；当两种方法联合使用时，224株结核分枝杆菌呈现出179种基因型，159株结核分枝杆菌具有独特的基因型，余下的65株菌表现为20种基因型。湖南省和安徽省的菌株中北京家族菌株所占的比例差异有统计学意义（P〈0．001），安徽省北京家族菌株所占的比例明显高于湖南省。结论MLVA在结核分枝杆菌株水平的鉴定方面，其分辨能力高于Spoligotyping，但是Spoligotyping在鉴定北京家族菌株和M.bovis方面有一定的优势。将Spoligotyping方法作为一线分型技术，MLVA作为二线分型技术联合应用时，将提高结核病的流行病学调查和病原学监测效果。不同地区的菌株有不同的特点。

多位点可变数量串联重复序列分析在细菌分子分型中的应用

多位点可变数量串联重复序列分析(multiple-locus variable number tandem repeat analysis,MLVA)是通过基因组中可变数量串联重复序列(variable number tandem repeat,VNTR)的特征来实现分型的分子分型技术,其特征是简单、快速、通量高、分辨力强,目前已广泛用于多种细菌分子分型。本文就MLVA技术的原理、在细菌分子分型中的应用及与其他分型方法的比较进行综述。

沈阳市2012年-2018年食源性致病菌监测金黄色葡萄球菌多位点可变数量串联重复序列分析分型

目的建立金黄色葡萄球菌监测的多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)分子分型数据库,提高金黄色葡萄球菌的检测和防控能力。方法筛选针对沈阳本地食源性致病菌具有高度多态性的VNTR位点,STTR1、STTR2、STTR3、STTR5、STTR6、STTR7、STTR8、STTR9共8个VNTR位点进行MLVA分型。结果186份样品检出金黄色葡萄球菌20株,检出率为10.8%。20株金黄色葡萄球菌共分成A和B两大聚类,分别占比65%和35%,A聚类可分为3个亚聚类,B聚类可分为2个亚聚类。表明沈阳地区流行的金黄色葡萄球菌是多克隆的,大部分菌株属于一个亲缘关系很近的克隆系。结论沈阳地区金黄色葡萄球菌MLVA分型呈较好的多态性。

沈阳市2011年-2015年食源性致病菌监测沙门菌多位点可变数量串联重复序列分型

目的建立沙门菌监测的多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)分子分型数据库,提高沙门菌的检测和防控能力。方法筛选针对沈阳本地食源性致病菌具有高度多态性的VNTR位点,选择STTR7、STTR3、SE6、2628542、3629542、SE10共6个VNTR位点进行MLVA分型。结果 917份样品检出沙门菌11株,检出率为1. 2%。11株沙门菌共分成A和B两大聚类,分别占比36. 4%和63. 6%,A聚类可分为1个亚聚类,B聚类又可细分为3个亚聚类。表明沈阳地区流行的沙门菌是多克隆的,大部分菌株属于一个亲缘关系很近的克隆系。结论沈阳地区沙门菌MLVA分型呈较好的多态性。

沈阳市2011年-2017年食源性致病菌监测副溶血性弧菌多位点可变数量串联重复序列分析分子分型

目的了解辽宁沈阳地区海洋产品中副溶血性弧菌的污染情况,建立副溶血性弧菌的多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)分子分型数据库,提高副溶血性弧菌的检测和防控能力。方法采集2011年-2017年沈阳及周边各地区历年来食源监测样品中副溶血性弧菌阳性菌株33株,利用PCR方法,结合毛细管电泳,对样品选择VPTR1、VPTR2、VPTR3、VPTR4、VPTR5、VPTR6以及VPTR7,7个位点进行副溶血性弧菌MLVA分型进行具体分型。结果本实验检测食品样品151份,检出阳性菌株33株,总检出率为21.85%。按VNTR基因分型及聚类,分成A(7株)、B(5株)和C(6株)三大聚类,分别占比38.9%、27.8%和33.3%。结论副溶血性弧菌MLVA分型呈较好的多态性。

我国汉族人群α1基因数目可变串联重复序列分布特征的研究

目的:研究我国汉族人群免疫球蛋白α1基因中3个数目可变串联重复序列(VNTR)多态性分布特征,及其与已报道的高加索人群相比较的特点。方法:从现存数据库中寻找α1基因内的3个VNTR位点,即α1基因3’端的hs1,2增强子内的VNTR1、其上游6Kb的VNTR2和位于α1基因第5外显子的E5VNTR。提取2 0 1例广东汉族人基因组DNA ,PCR分别扩增含上述3个VNTR位点片段,2 % - 3%凝胶电泳分带鉴定基因型,并以测序证实。结果:与高加索人群比较我国汉族人群α1基因VNTR1多态性分布特征表现为:C(3次重复)等位基因频率明显升高(10. 0 %vs 1 0 % ) ,A(1次重复)等位基因频率偏低(30 . 3%vs36. 1% - 39 .4 % ) ,差异显著(χ2 =72 .85 ,P <0 .0 1)。基因型BB占37. 8% ,AB占32. 3% ,AA占12 % ,BC占11 .4 % ,AC占4 5 % ,CC占2. 0 % ,BC、AC基因型分布频率显著高于高加索人群,而AB型分布频率显著低于高加索人群(χ2 =73. 77,P <0 .0 1)。另外两个数据库中报道的VNTR位点(VNTR 2及E5VNTR)在我们所测人群中呈均一分布,PCR产物长度分别为136bp(VNTR 2 )和5 35bp(E5VNTR)。结论:我国汉族人群α1基因VNTR多态性分布与基因组数据库中基于高加索人群的资料不尽相同,其中Iα1hs1,2VN TR1多态性不同于高加索人群。

中国炭疽芽胞杆菌中11个串联重复序列位点的特征和分布

目的检测炭疽芽胞杆菌中可变数量串联重复序列(VNTR)的变化,分析我国菌株中VNTR的特征和分布规律。方法 PCR扩增,琼脂糖电泳和毛细管电泳,测序验证,BLAST比对等。结果 11个VNTR位点中有4个在所有菌株中没有差别,另外7个位点只在个别菌株中检测到差别,有差别的菌株多分布在新疆;11个VNTR位点均位于基因编码区内,编码对细菌生存重要的蛋白和一些功能不明蛋白。结论结果提示新疆的菌株类型较复杂;本研究中的VNTR位点比较保守,可能不能用于区别不同的炭疽芽胞杆菌,但对于了解炭疽芽胞杆菌的基因组特征以及鉴定炭疽芽胞杆菌具有一定的作用。

布鲁菌多位点可变数目串联重复序列分析的分型研究

目的采用多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）方法对山西省分离的布鲁菌进行基因型分析。方法2012、2013年，在山西省布鲁菌病（简称布病）监测点，采集已确诊的布病患者血液，进行血培养，对培养出的布鲁菌进行传统的生物分型鉴定。选取MLVA的16个位点[分为2组：panel 1、panel 2（包括panel 2A、panel 2B）]．对分离的布鲁菌进行MLVA分型，并对分型结果进行聚类分析。结果2012、2013年，共分离47株羊种3型布鲁菌；MLVA分型后进行聚类分析，发现分离的菌株高度同源，均为东地中海型；菌株可分为A群和B群。A群为优势基因群；panel 2B的Bruce04、Bruce16及Bruce30位点的变异度较高。结论在同一年份，相邻地区的布鲁菌菌株MLVA分型结果一致或相近，对追溯传染源、分析布病的流行和爆发有重要意义。Danel 2B的Bmce04、Bruce16及Bruce30位点的变异度高，提示这3个位点对分析研究同一生物型菌株的变异情况有价值。

220株结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型研究

目的了解结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型种类和特征,为结核病防治研究提供基础科学依据。评价两种分型方法在北京地区结核病分子流行病学中的应用。方法收集北京市结核分枝杆菌临床分离株,应用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)二种分型方法进行基因分型,结果聚类分析采用BioNu-merics(Version5.0)软件。结果共在北京地区收集到220株结核分枝杆菌临床分离株。采用Spoligotyping分型方法,220株菌可分为2个基因群,即北京家族(Beijing family)和非北京家族(non-Beijing family),20种基因型。其中北京家族含有202株菌,占91.82%。北京家族菌株中,典型北京家族菌株占95.05%(192/202),非典型北京家族占4.95%(10/202)。北京家族菌株的耐药率为22.55%(22/98),非北京家族菌株的耐药率为16.67%(1/6),两者间的差异无统计学意义(fisher analysis,P=0.5835>0.05)。采用MLVA分型方法,202株菌可分成5个基因群59种基因型,主要为Beijing family、China2和China3,分别占91.37%、2.73%和4.55%。结论北京地区结核分枝杆菌具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族。北京家族菌株与耐药性无明显相关性。

辽宁省炭疽芽胞杆菌MLVA分型研究

目的了解辽宁地区炭疽芽胞杆菌的流行特征及菌型基因特征。方法通过多位点可变数目串联重复序列(Multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis,MLVA)分型实验,对2001—2011年辽宁省分离到的6株炭疽芽胞杆菌分离株DNA进行检测,DNA指纹图谱使用BioNumerics 4.0软件进行统计分析,得出聚类分析结果。结果聚类分析发现,6株炭疽芽胞杆菌株可分为2个基因型。对于炭疽暴发而言,其可变数目串联重复序列遗传标记具有高度相似性。结论炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列可作为炭疽芽胞杆菌基因分型的指标,在炭疽暴发事件中的病原体溯源上具有重要的意义。

江苏省67株结核分支杆菌MLVA分型分析

目的初步探讨江苏省结核分支杆菌的数目可变串联重复序列(VNTR)的分布特征。方法采用多位点串联重复序列(MLVA)分型方法,对从江苏省病人分离的结核分支杆菌的VNTR进行PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳,通过BioNumerics3.0软件分析其VNTR的多态性和聚类分析。结果共选取了15个VNTR位点,对67株结核分支杆菌进行了检测分析,结果显示明显的基因多态性,可分8个基因型(Ⅰ～Ⅶ型),其中较多的一型菌株占32.6%,其他型别菌株数量较接近,没有特别明显的优势型别。结论江苏省结核分支杆菌具有明显的多态性,MLVA分型技术具有稳定、简单、可重复的优点,可用于结核分支杆菌的流行病学调查。

用MLVA技术和多重PCR对犬种布氏菌基因分型

目的:对犬种布氏菌的遗传关系进行不同分子分型方法的对比研究,为犬布病分子流行病溯源提供有效方法。方法:采用多重PCR和多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)方法对24株犬种布氏菌的遗传关系进行比较研究。结果:多重PCR只鉴定出1株犬种布氏菌,其余23株均鉴定为猪种鲁氏菌,但不能鉴定型别;MLVA方法对已鉴定为猪种的布氏菌仍可再细分为型,87%(20/23)为猪3型,13%(3/20)为猪1型。结论:MLVA可以对布氏菌种(生物型)进行基因分型鉴定,可以作为传统表型鉴定方法的补充。

肺炎支原体耐药性及分子流行病学研究进展

肺炎支原体是临床上非典型性肺炎常见的致病菌,主要采用大环内酯类抗菌药物治疗。近年来,肺炎支原体对大环内酯类耐药性日趋严重,且全世界各地耐药率存在差异,目前认为其耐药机制主要与23S rRNA V区基因位点突变(2 063位和2 064位)相关。根据肺炎支原体菌株P1基因序列的不同,应用聚合酶链式反应-限制片段长度多态性分析(PCR-RFLP)可分为Ⅰ型和Ⅱ型,其流行基因型随地区和时间的不同而不同。另外,为了解肺炎支原体耐药菌株之间是否存在克隆传播,可采用多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)方法分析肺炎支原体克隆型。加强肺炎支原体的耐药性及流行基因型的监测,有助于了解肺炎支原体的流行病学特点,为新型抗菌药物及疫苗的研发提供依据。

我国汉族人群免疫球蛋白α1基因增强子区域hs1,2 VNTR多态性与高加索人种的比较

【目的】研究我国汉族人群免疫球蛋白α1基因增强子hs1,2 VNTR多态性分布特征,并与已报道的高加索人群特点作比较。【方法】提取201例汉族人基因组DNA,PCR分别扩增含Iα1 hs1,2片段。凝胶电泳分带鉴定基因型,并以测序证实。【结果】我国汉旅人群Ia1 hs1,2 VNTR多态性分布为BB型76例(37.8%), AB型65例(32.3%),AA型24例(12.0%),BC型23例(11.4%)AC型9例(4.5%)CC型4例(2.0%),与国外人群相比,BC、AC、CC型分布频率显著高于高加索人群,而AB型分布频率显著低于高加索人群(x2=73.77, P<0.001)。等位基因频率分析显示我国汉族人群同样与高加索人群存在显著性差异(x2=72.85,P<0.001)。【结论】我国汉族正常人群Iα1 hs1,2 VNTR多态性不同于高加索人群,突出表现为C等位基因频率及BC、AC、CC基因型频率显著高于高加索人群。这种差异有可能是导致一些IgA相关疾病在不同种族间发病率和临床表现型上存在显著差异的因素之一。

Iα1基因hs1,2区B等位基因与IgA肾病的易感性相关

目的研究Iα1hs1,2VNTR多态性与我国IgA肾病的相关关系。方法采集419例肾活检证实的IgA肾病患者及其一级亲属、条件相当的201例健康志愿者血样,提取基因组DNA。用PCR产物直接电泳法鉴定Iα1hs1,2VNTR基因型,采用以家庭为基础的传递/不平衡分析(TDT)和单倍型相对危险度(HRR),以及病例-对照研究分析Iα1hs1,2VNTR多态性与我国IgA肾病的相关关系。结果①TDT分析结果显示Iα1hs1,2VNTR B等位基因从杂合子父母向患者传递的频率显著高于预期值(101Trios,χ2=6.818,P<0.01,扩展TDT分析也得到相同结果(164家庭,χ2=7.583,P<0.01)。②与TDT结果一致,HRR分析同样显示Iα1hs1,2VNTR B等位基因的过度传递(P<0.05,χ2=4.122,HRR=1.180),而BB基因型具有更强的患病倾向(P<0.05,χ2=4.411,OR=1.538)。③病例-对照研究显示IgA肾病组B等位基因频率显著高于正常对照组(χ2=6.968,P<0.05)。结论Iα1hs1,2VNTR基因多态性与我国IgA肾病患者的易感性相关。

改良MLVF与MLVA及PFGE对医院流行耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分型研究

目的旨在建立一种操作简便、分型分辨率高以及成本低的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分子分型方法,对多位点可变数量串联重复序列指纹法(MLVF)进行了方法学改良及分型能力比对评估。方法应用42株MRSA参考菌株对改良MLVF分型能力进行验证;应用116株东北三省六家医院的MRSA临床菌株对改良MLVF、脉冲场凝胶电泳(PFGE)及多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)进行了方法学比对。结果改良MLVF对42株参考菌株分型率为100%;改良MLVF、PFGE和MLVA分别将116株临床菌株分成28个型(simpson's多样性系数[SID]=0.855),28个型(SID=0.854)和27个型(SID=0.816)。改良MLVF在区分国内最主要流行克隆CC239和其他克隆方面分辨率优于MLVA。改良MLVF在分群水平上与PFGE分型一致性(adjusted Rand’s,AR系数0.989)优于MLVA(AR指数0.765)。结论改良MLVF具有分辨率高、与金标准PFGE分型一致性好、操作简单、高通量、费用低的优点,适合常规实验室对MRSA进行分子分型,为常规感控工作及分子流行病学研究提供有力工具。

MLVA和Spoligotyping用于西藏地区216株结核分枝杆菌临床分离株的基因分型研究

目的评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)两种分型方法在西藏地区结核病分子流行病学中的应用。方法收集西藏地区结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)临床分离株,应用Spoligotyping及MLVA两种分型方法进行比较分析。结果共在西藏地区收集到216株结核分枝杆菌临床分离株,采用Spoligotyping分型方法,216株菌可分为3个基因群13种基因型,其中最大的1个基因群即北京家族(Beijing family)含有195株菌,占90.28%。北京家族菌株中,有BCG接种史者占45.64%(89/195),无BCG接种史者占54.36%(106/ 1195),两者间的差异无统计学意义(x^2=0.059,P>0.05)。采用MLVA分型方法,216株菌可分成19个基因群108种基因型,其中80种基因型只有1株菌,占37.03%(80/216),另有136株菌表现出28种基因型,成簇数为28,占62.96%(136/216)。在20个VNTR位点的等位基因多态性发现Miru31位点的多态性最高,多态性指数(h)达到0.77,而Mtub29、Mtub12位点的多态性较差,都低于0.05。其中Mtub02位点可鉴别北京家族和非北京家族,它鉴别的北京家族与Spoligotyping鉴别的北京家族符合率达到100%。结论西藏地区结核分枝杆菌具有明显的接引多态性,其主要流行型为北京家族。北京家族菌株与BCG接种无相关性。应用Spoligotyping和MLVA两种分型方法进行结核病流行病学研究,将提高结核病的流行病学调查和病原学监测效果。

辽宁省2010年布鲁氏菌病疫情及MLVA分型

布鲁氏菌病（brucellosis,简称布病）是由布鲁氏菌属（Brucella）细菌侵入机体引起的人兽共患的传染-变态反应性疾病。近些年,辽宁省布病疫情呈明显的上升趋势,居中国前列,对人民生命财产安全造成了巨大的威胁[1]。多位点可变数目串联重复序列（multiple locus variable numbers of tandemrepeats analysis,MLVA）[1]即多位点可变数量串联重复序列分析,是近年发展起来的以PCR为基础,