可控细胞膜孔形成蛋白基因的克隆与表达

根据Wood 4 6株金黄色葡萄球菌α溶血素 (α HL)基因序列设计了引物 ,用高保真PCR从 180 0株金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出了 0 .9kb的α HL基因 ,序列测定结果显示 ,两菌株α HL基因的核苷酸序列有 6个碱基差异 ,但仅引起 1个氨基酸替换。用PCR分段克隆和定点突变技术将大肠埃希氏菌外膜蛋白A信号肽序列与α HL编码区融合 ,并将其第 130～ 134位氨基酸替换为 5个连续的组氨酸 ,获得的融合基因命名为H5基因。将其克隆入 pET 30a质粒 ,用获得的重组质粒pET H5转化感受态大肠埃希氏菌 ,获得分泌性表达H5的重组菌。经IPTG诱导后 ,重组菌表达出分子质量为 35ku的H5蛋白。经镍柱亲和层析纯化的H5对兔红细胞的半数溶血值为 180ng/mL ,能使鼠成纤维细胞PA317获得对台盼蓝和海藻糖的通透性 ,且能被Zn2 + 抑制。提示 ,表达的H5蛋白为可控细胞膜孔形成蛋白 。