可评价注射式再生支架修复效果的小鼠骨缺损模型的构建研究

目的建立小鼠股骨缺损模型并探索甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl,GelMA)对缺损后骨再生的影响。方法将40只8周龄的雌性C57BL/6N小鼠随机分成4组:骨缺损组(n=10),5%GelMA组(n=10),10%GelMA组(n=10),15%GelMA组(n=10)。造模2周后,使用HE染色观察股骨组织结构;使用Masson染色观察股骨胶原纤维形态;使用OCN免疫组化染色分析骨特异性蛋白表达水平。结果GelMA具有良好的可注射性,可经PCR Pipettes移液器注入骨缺损区。HE染色结果表明10%GelMA组相较于骨缺损组、5%GelMA组和15%GelMA组具有更好的骨修复效果,缺损部位组织结构更加完整;Masson染色结果表明10%GelMA组有更多成骨相关的胶原纤维形成;RT-qPCR分析显示,10%GelMA组小鼠骨缺损部位OCN表达显著高于骨缺损组(P<0.001)、5%GelMA组(P<0.01)和15%GelMA组(P<0.01)。10%GelMA组小鼠骨缺损部位Osterix表达显著高于骨缺损组(P<0.001)、5%GelMA组(P<0.001)和15%GelMA组(P<0.01);OCN免疫组化染色结果表明10%GelMA组的修复区骨特异性蛋白表达显著高于骨缺损组(P<0.01)、5%GelMA组(P<0.01)和15%GelMA组(P<0.05)。结论构建了可评价注射式再生支架修复效果的小鼠骨缺损模型,并应用于基于GelMA的可注射再生支架筛选和治疗效果评价,为开展相关领域工作提供实验基础。

低分子凝胶M2和交联透明质酸作为可注射性软骨再生支架的可行性研究

目的探讨以低分子量凝胶M2和交联透明质酸(Hyaluronic acid,HA)作为可注射性支架材料,在裸鼠体内构建组织工程软骨的可行性。方法常规分离、体外单层培养新生猪耳软骨细胞,将获得的软骨细胞以50×106 cells/m L和100×106cells/m L的浓度分别与M2凝胶混合,以100×106 cells/m L的浓度与交联HA混合,分别注射于裸鼠皮下,并于8周后取材。以单纯M2凝胶及单纯HA作为对照组。通过大体观察、组织化学检查、湿重测定、力学检测、蛋白聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)含量测定,判断低分子量凝胶M2及交联透明质酸在体内形成软骨的能力。结果实验组3组均可形成软骨样组织块。其中,M2+高浓度细胞组体积最大、质地较硬、表面光滑,软骨细胞位于成熟的陷窝中;M2+低浓度细胞组形成与高浓度细胞组质地相似的组织块,但体积相对较小;HA组形成不成熟的组织块,硬度差,含有的细胞数和分泌的基质最少。同时,实验组3组的力学和GAG含量结果也证实M2+高浓度细胞形成的软骨更加成熟。各组间具有显著性差异。2个对照组未有类软骨组织形成。结论低分子凝胶M2与软骨细胞的生物相容性优于交联HA,更适合作为可注射性支架材料用于组织工程化软骨的构建。

3种可注射性支架体内构建组织工程软骨的比较研究

目的比较以纤维蛋白封闭剂(FS)、P luron ic-F 127(PF)、透明质酸(HA)3种可注射性支架体内构建组织工程软骨的效果。方法常规分离、消化、体外单层培养新生兔软骨细胞,分别将软骨细胞与3种支架材料混合接种于裸鼠皮下,并于第10周取材通过大体观察,湿重测定,GAG含量测定和组织化学检查来判断体内形成软骨的能力。结果三组均可形成软骨样组织块,其中FS组体积最大,质地较硬,表面光滑,软骨细胞位于成熟的陷窝中,阿尔新兰及Ⅱ型胶原免疫组化染色强阳性;PF组体积中等,质地柔韧,陷窝清楚,可以检测到阳性的阿尔新兰及Ⅱ型胶原表达。HA组只形成很小的组织块,硬度较差,含有的细胞数和分泌的基质最少,三组的GAG含量分别为(8.8±0.4)m g/g,(6.8±0.3)m g/g,(4.2±0.3)m g/g,各组间差异具有显著性(P<0.05,n=3)。结论3种可注射性支架中,FS成软骨作用最强,PF较好、HA组最差,FS和PF可以用于组织工程软骨的构建。

聚内酯类生物降解性高分子微球可注射细胞支架

目的:用于组织工程化软骨、骨、脂肪等修复重建和整形用的可注射细胞支架。方法:以聚丙交酯(PLLA)、聚丙交酯/聚乙二醇共聚物(PLE),以及聚己内酯/聚乙二醇/聚丙交酯共聚物(PCEL)等聚内酯类生物降解高分子为基材,采用乳液-溶剂挥发法制成微米级大小、具有一定形态结构的微球。结果:聚内酯材料的组成对微球的形态结构有重要影响,微球的孔结构和稳定剂种类对微球的细胞亲和性有重要影响;含聚乙二醇成分的聚内酯材料可以形成呈多孔结构的微球,且以明胶为稳定剂制备的微球细胞亲和性更好。结论:聚内酯类生物降解高分子微球具有可注射性和良好的细胞亲和性,是一类具有应用前景的可注射细胞支架。

人脂肪干细胞与聚L-谷氨酸/海藻酸钠可注射水凝胶的生物相容性研究

天然高分子聚合物聚L-谷氨酸(PLGA)与氧化海藻酸钠(OAg)共价交联合成PLGA/OAg水凝胶,将人脂肪来源干细胞(hADSCs)接种于水凝胶内,倒置显微镜、扫描电镜观察细胞在支架中的存活、增殖、黏附情况,DNA定量法检测细胞的增殖。体外证实该水凝胶材料生物相容性良好,具有性能可控性和微创性等优势,对于进一步开发脂肪组织工程材料具有指导性意义。

脂肪干细胞与温敏型支架构建人工髓核的体外研究

目的评测壳聚糖基温敏型支架与诱导后脂肪干细胞的相容性及对其功能状态的影响。方法将兔脂肪干细胞体外培养3代、诱导2周,RT-PCR检测细胞内RNA表达水平,证明向髓核分化后,与制备好的支架复合,37℃成胶后,培养2周,行AO/PI检测细胞存活情况,并以扫描电镜观察超微结构。结果脂肪干细胞在单层诱导培养后有Ⅱ型胶原(ColⅡ)和蛋白聚糖(Aggrecan)表达;与支架复合后,细胞90%以上存活,复合培养2周后无去分化现象,且ColⅡ、Aggrecan mRNA表达水平升高(P<0.05)。结论温敏型壳聚糖支架与诱导后脂肪干细胞相容性良好,一定程度上利于干细胞表型、功能的维持与进一步分化,可作为干细胞植入的可注射性载体材料。

可注射壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料的生物相容性实验研究

目的评价可注射壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料的组织相容性,以及探讨材料负载骨髓基质干细胞进行骨修复的可行性。方法壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原材料与BrdU标记的rBMSc混合,注射入大鼠皮下,于皮下植入后24 h,14 d和28 d分别断颈处死大鼠,进行大体观察、HE、MASSON染色、免疫组化染色。结果壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原材料在室温呈液态,经1 ml注射器26号针头注射入大鼠皮下后,材料在体内可以迅速原位成形成凝胶状态,并在原位保持形状,BrdU标记的rBMSc弥散于材料中,28 d的免疫组化结果显示细胞存活良好。结论壳聚糖/纳米羟基磷灰石/胶原复合材料具有良好的组织相容性,是一种良好的负载干细胞的骨组织工程支架。

注射型猪小肠黏膜下层与脂肪间充质干细胞的体外共培养

背景:经脱细胞处理的猪小肠黏膜下层是一种具有生物活性的细胞外基质,主要由胶原、糖蛋白、蛋白多糖等组成,富含胶原、氨基葡聚糖和各种生长因子,这些组分在促进组织细胞的分化和快速增殖中发挥了重要作用。目的:制备可注射型猪小肠黏膜下层,观察其与大鼠脂肪间充质干细胞的体外共培养情况。方法:制备可注射型猪小肠黏膜下层与SD大鼠脂肪间充质干细胞。(1)CCK-8法检测细胞增殖:将第3代脂肪间充质干细胞接种到可注射型猪小肠黏膜下层上(实验组),以正常培养的细胞为对照组,培养1,3,5,7 d观察细胞增殖;(2)Live/dead染色法检测细胞存活:分别以猪小肠黏膜下层浸提液(实验组)与完全培养基培养(对照组)第3代脂肪间充质干细胞,培养1,3,5,7 d观察细胞存活。结果与结论:(1)扫描电镜观察结果:脂肪间充质干细胞能在材料上很好黏附,呈椭圆形和条索状生长;(2)细胞增殖结果:实验组培养1,5 d的细胞A值高于对照组(P<0.05);(3)细胞存活:随时间延长,两组中细胞数量均呈上升趋势,共培养第1天时,两组细胞基本全部存活,随后可见两组均有死细胞出现,两组死细胞数在各时间点无明显差别;(4)结果表明:可注射型猪小肠黏膜下层具有良好的细胞相容性。

生物支架材料——组织工程连载之二

具有三维结构的支架材料是组织工程的核心内容之一。现有组织工程支架可分为天然生物材料、合成有机材料和无机材料三类。支架材料近年来研究十分活跃,不仅在组织工程的最早产品人工皮肤领域进行了更为完善的研究和开发,同时在诸如人工骨、软骨、神经、血管、皮肤、肝、脾、肾、膀胱等方面进行了大量研究和探索。与普通组织工程支架需要预先制备并在体外成型不同,近年来在骨和软骨组织工程实践中兴起的可注射支架具有许多优势,是未来组织工程支架发展的重要方向之一。

脂肪干细胞构建可注射型组织工程脂肪的研究进展

目的总结近年来以脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)作为种子细胞构建可注射型组织工程脂肪的研究进展。方法检索国内外ADSCs复合可注射型三维支架材料构建组织工程脂肪的相关研究文献,主要对ADSCs特性、可注射型支架材料创新、分化诱导方式和促进血液供应等方面研究成果进行总结。结果ADSCs具有数量充足、强大的分泌功能等特性,与多种可注射型支架材料复合后相容性良好,辅以生长因子等促进血液供应的策略,可构建多种形式的可注射型组织工程脂肪。结论以ADSCs为种子细胞构建可注射型组织工程脂肪虽然面临诸多亟待解决的问题,但其可能为临床上修复软组织缺损和整形填充提供一种优良、易操作的可注射型填充材料。

海藻酸钠-壳聚糖微囊化成骨细胞复合磷酸钙骨水泥的体外研究(英文)

研究目的:本研究应用海藻酸钠-壳聚糖微囊保护成骨细胞,接种到β-磷酸三钙/磷酸钙骨水泥(β-TCP/CPC)浆料中,使β-TCP/CPC骨修复材料具有一定的细胞活性,同时提高固化后材料的孔隙率和孔径,以最终实现提高β-TCP/CPC骨水泥的降解速度,加快成骨和骨修复。创新要点:本研究首次应用海藻酸钠-壳聚糖微胶囊包封成骨细胞与CPC浆料复合,复合后实现自动细胞释放,释放出的细胞具有良好的生物学活性。研究方法:(1)高压静电成囊法制备载小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1)的海藻酸钙和海藻酸钠-壳聚糖微胶囊;(2)微囊化MC3T3-E1细胞,进行体外培养,使用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活性,并用钙黄绿素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)进行活死细胞双重染色;(3)微囊化MC3T3-E1细胞与β-TCP/CPC浆料复合培养后,激光共聚焦扫描显微镜和环境扫描电子显微镜观测细胞在材料上的释放、粘附,CCK-8法检测材料上细胞的活力,碱性磷酸酶(ALP)检测观察细胞的分化状况,茜素红染色观察释放细胞的矿化能力。重要结论:海藻酸钠-壳聚糖微胶囊可作为可注射磷酸钙骨水泥内部接种成骨细胞并实现细胞释放的良好载体,释放出的成骨细胞具有良好的生物学活性。