可溶态和膜结合态双孢蘑菇多酚氧化酶的分离纯化及酶特性分析

为开发一种双孢蘑菇两种不同形态多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)的提取纯化方法,通过温度诱导相分配、分步硫酸铵沉淀盐析、DEAE阴离子交换层析,对双孢蘑菇中的可溶态PPO(soluble PPO,sPPO)和膜结合态PPO(membrane-bound PPO,mPPO)进行分离纯化,并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳和Native-聚丙烯酰氨凝胶电泳及米氏方程对纯化后两种形态PPO的纯度、分子质量及酶促反应动力学进行探究。双孢蘑菇sPPO和mPPO经纯化后对邻苯二酚的比活力分别达到6912.88 U/mg和19092.94 U/mg,相比于粗酶液,酶的比活力分别提高到12.20倍和10.86倍,且纯化后mPPO的比活力显著高于sPPO。酶促反应动力学结果显示,sPPO和mPPO对不同底物的催化活性差异较大,对底物邻苯二酚的催化活性较高,且mPPO比sPPO对底物邻苯二酚的亲和力更强,酶促反应速度更高。sPPO和mPPO对邻苯二酚的最适反应温度均为30℃,最适pH值均为6.8。本研究为双孢蘑菇两种状态PPO的质谱鉴定、酶学特性以及抑制酶促褐变的发生等研究奠定了基础。

可溶态和膜结合态马铃薯多酚氧化酶的性质对比

以大西洋马铃薯为原料,制备可溶态(s PPO)和膜结合态(mPPO)多酚氧化酶,并对两种粗酶液的酶学性质进行研究。结果表明,s PPO最适反应温度为35℃,最适p H值为7,mPPO最适反应温度为30℃,最适pH值为7。以焦性没食子酸、邻苯二酚为底物时,sPPO的米氏常数(Km)分别为10.04 mmol/L和24.00 mmol/L,最大反应速度(Vmax)值分别为443 U/(mL·min)和965U/(m L·min),mPPO的米氏常数(Km)分别为4.98 mmol/L和48.04 mmol/L,最大反应速度(Vmax)值分别为299 U/(mL·min)和912U/(m L·min),且对焦性没食子酸的催化效果优于邻苯二酚。6种抑制剂对比发现,Na2SO3对sPPO活性的抑制效果最好,Vc对mPPO活性的抑制效果最好。sPPO和mPPO的酶学特性有一定的差异,对马铃薯制品加工过程中酶促褐变的控制具有指导意义。

响应面优化可溶态和膜结合态马铃薯多酚氧化酶提取工艺

以大西洋马铃薯为原料,分别用柠檬酸-磷酸盐缓冲液浸提和超声波辅助Tris-HCl缓冲液浸提法提取马铃薯中可溶态(sPPO)和膜结合态(mPPO)多酚氧化酶,以酶比活力为评价指标,在单因素实验基础上,通过响应面对sPPO和mPPO的提取工艺进行优化。结果显示:sPPO最优提取工艺为料液比1∶3.2、浸提时间12 h、缓冲液pH7.1,在该条件下测定sPPO比活力平均值为(130.5±2.4) U/mg,三个因素对sPPO提取的影响大小依次为:浸提时间>料液比>缓冲液pH。mPPO最优提取工艺为料液比1∶5.2、浸提时间7 h、缓冲液pH6.7,在该条件下测定mPPO比活力平均值为(686.4±7.9) U/mg,三个因素对mPPO提取的影响大小依次为:超声时间>料液比>缓冲液pH。所得响应面模型可以很好地预测和分析sPPO和mPPO提取工艺条件。

不同品种马铃薯多酚氧化酶酶学特性对比

以大西洋、费乌瑞它、红宝石和黑美人4个马铃薯品种为原料,提取可溶态(sPPO)和膜结合态(mPPO)多酚氧化酶,对比不同品种马铃薯sPPO和mPPO的酶学特性。结果表明,黑美人和红宝石的sPPO和mPPO粗酶液浓度均高于大西洋和费乌瑞它,黑美人和红宝石sPPO和mPPO的最适pH为6.0,略低于大西洋和费乌瑞它;大西洋sPPO的最适反应温度为35℃,其他3个品种马铃薯sPPO的最适反应温度均为30℃,大西洋和费乌瑞它mPPO的最适反应温度为30℃,黑美人和红宝石mPPO的最适反应温度为25℃;4个品种马铃薯sPPO和mPPO在邻苯二酚反应体系中最适底物浓度均为50 mmol/L;黑美人sPPO和mPPO的Vmax/Km比值分别为93.0和38.7,高于其他3个品种,黑美人sPPO和mPPO的酶促反应速度最快,大西洋的酶促反应速度最慢。不同品种马铃薯sPPO和mPPO酶学性质存在差异,对马铃薯制品加工的品种选择及加工过程中的酶促褐变控制技术具有指导意义。