抗克伦特罗单链抗体可溶性表达及特性鉴定

目的:表达抗克伦特罗(CBL)可溶性单链抗体(scFv)并进行抗原结合活性鉴定。方法:利用呈现scFv的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2151,IPTG诱导可溶性scFv表达。渗透休克法提取菌体细胞周质腔中scFv。经SDS-PAGE、Western-Blotting以及间接ELISA法分析检测可溶性scFv的表达,并采用间接竞争ELISA法鉴定scFv的抗原结合活性。结果:细菌培养上清及周质腔中均有抗CBL可溶性scFv表达,其分子量约为29kD;上清液及周质腔中scFv效价分别为1:80,1:1600,能够被CBL竞争性抑制,IC50分别为0.78、0.95ng/ml。结论:可溶性抗CBLscFv在大肠杆菌HB2151中获得成功表达,表达的scFv与CBL具有很好的结合活性,可用于进一步建立CBL相应的免疫学检测方法。

抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌中可溶性表达条件的研究

通过优化诱导表达条件,实现抗镰刀菌单链抗体在大肠杆菌周质中高效可溶性表达。将抗镰刀菌单链抗体FvSG7转化到大肠杆菌XL1-Blue中,确定诱导表达培养基,在不同的诱导温度、诱导剂IPTG的浓度和诱导时间条件下培养重组大肠杆菌,通过Western杂交和ELISA检测分析单链抗体的可溶性表达情况以及抗体的活性。重组大肠杆菌培养至OD600nm为0.5时加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG,25℃诱导表达2 h可获得最大量的可溶性单链抗体。通过对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间等表达条件的优化,可以显著提高Fv SG7抗体在大肠杆菌XL1-Blue周质中的表达量。

抗转铁蛋白受体单链抗体的可溶性表达及其对脑的靶向性研究

分段合成大鼠抗转铁蛋白受体单链抗体基因 (ox2 6_scFv) ,经三轮PCR拼接成 794bp的完整片段。测序后构建pTIG_Trx ox2 6_scFv表达载体 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得了可溶性表达 ,经Ni_NTA金属鏊合层析柱纯化 ,在2 9kD处可见单一条带。大鼠GH3细胞免疫组化显示 ,该单链抗体能识别并与转铁蛋白受体结合。将单链抗体尾静脉注射大鼠 ,于鼠脑组织切片上可见阳性染色 ,尤其是脑血管处着色明显 ,说明该单链抗体对脑血管具有较好的靶向作用 ,并在受体的介导下通过了血脑屏障。

抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体的表达及鉴定

前期采用核糖体展示技术筛选了抗柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri,Xac)高亲和力单链抗体(Single chain variable fragment,scFv)GX13、GX44和GX95,为高效表达具有生物活性的单链抗体,本研究将前期筛选的高亲和力单链抗体基因转入大肠杆菌HB2151中进行可溶性表达,点印迹和Western印迹检测可溶性单链抗体的表达水平,亲和层析纯化表达的单链抗体,酶联免疫吸附法(ELISA)检测纯化单链抗体的抗原结合活性.结果显示,3株抗柑桔溃疡病菌可溶性单链抗体在大肠杆菌HB2151中均获得成功表达,表达产物分子量(Mr)约为32.0×103,主要集中于细菌周质腔中.ELISA检测纯化的单链抗体都具备抗原结合活性,可进一步应用于柑桔溃疡病菌的免疫诊断和病害防治.

抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体的筛选、可溶性表达及鉴定

目的筛选具有较好结合能力的抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体(scFv),并进行可溶性表达和鉴定。方法前期实验室构建了抗木瓜凝乳蛋白酶全套鼠源scFv噬菌体抗体文库,对抗体文库进行4轮富集后,采用ELISA筛选抗木瓜凝乳蛋白酶阳性scFv;将ELISA最强阳性克隆p FAB5C-scFv的重组噬粒切除gene 3 singal后进行表达,SDS-PAGE分析、双抗体夹心ELISA分析、鉴定表达产物,并将阳性克隆可变区序列与Gene Bank数据库进行同源性比较。结果经4轮噬菌体展示富集,筛选到3株亲和力相对较高的阳性克隆;去除gene 3 singal后的重组scFv在宿主菌E.coli XL1-blue中主要以可溶性的形式进行了表达,且对木瓜凝乳蛋白酶有较好的亲和力。基因序列分析表明阳性克隆所包含的重链可变区基因(VH)与小鼠免疫球蛋白γ重链基因同源性达96%,轻链可变区基因(VL)和小鼠免疫球蛋白轻链κ基因同源性达98%。结论成功筛选出结合能力较好的抗木瓜凝乳蛋白酶scFv并进行了可溶性表达,所克隆的scFv基因符合小鼠抗体序列的特征。

抗克百威单链抗体的可溶性表达载体的构建及鉴定

为构建克百威(carbofuran,CBF)单链抗体(sc Fv)可溶性表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以p CANTAB5E-sc Fv质粒为模板扩增CBF的重链(VH)及轻链(VL)片段,通过引物设计引入由15个氨基酸组成的连接肽(Gly4Ser)3,经重叠延伸拼接重链及轻链片段,并通过PCR扩增得到sc Fv基因,再与载体p LIP6/GN连接,转化大肠杆菌BL21,阳性克隆质粒经PCR鉴定并测序。重组菌经0.6μmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)及低温诱导表达重组单链抗体,并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用ELISA法检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒p LIP6/GN-sc Fv含有插入片段,sc Fv与碱性磷酸酶(AP)相连得到重组蛋白的分子量接近78 ku,可被游离的CBF竞争性抑制,IC50值为26.80 ng/m L。这说明成功构建了重组质粒p LIP6/GN-sc Fv并实现了其在大肠杆菌中的可溶性表达,为研究其在免疫分析方法中的应用奠定了基础。

抗AIF单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达和鉴定

目的:获得具有生物活性的抗酸性同功铁蛋白(AIF)单链抗体(scFv)。方法:将AIF4c9scFv基因亚克隆于原核表达载体pPOW3,构建重组表达质粒pPOW4c9,电转化大肠杆菌DH5α,以温度诱导重组抗AIFscFv表达,经镍螯合层析柱纯化后,用ELISA和Westernblot检测表达蛋白与AIF的结合特性。结果:抗AIFscFv抗体在大肠杆菌中获得可溶性表达,亲和力常数KD为3.18×10-8mol/L;纯化后的可溶性AIFscFv含量约为1.6mg/L。重组蛋白能特异识别AIF,并且具有良好的抗体生物学活性。结论:在大肠杆菌中表达并纯化了特异性可溶性抗AIFscFv抗体。

猪蛔虫卵可溶性抗原单链抗体库的构建及初步筛选

为进一步研制抗猪蛔虫的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定基础,以猪蛔虫未成熟虫卵可溶性抗原免疫BALB/C小鼠,提取小鼠脾脏总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出H链和L链可变区基因,以SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段,然后将ScFv片段克隆至pCANTAB-5E载体,并转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,构建猪蛔虫卵可溶性抗原噬菌体展示单链抗体库,结果从20个噬菌体克隆中筛选到15个阳性克隆。

单克隆抗体3D8可溶性单链抗体的表达

单克隆抗体３Ｄ８可溶性单链抗体的表达闫岩，汪美先，徐志凯，尹文，汪力亚，王海涛，祝道成，张劲翼（第四军医大学微生物学教研室，西安７１００３２）３Ｄ８是本室研制的具有高血凝抑制活性、高中和活性和高保护性的抗肾综合征出血热病毒血凝素小鼠单克隆抗体。作者已...

日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及初步应用

运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26～28ku特异性scFv大量表达.随后以此为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,以期获得SIEA26～28ku天然分子候选疫苗相关的编码基因.结果显示,所获得的SIEA26～28ku特异性scFv,表达量高,采用该探针初步筛选出相关基因核糖体蛋白S4.SIEA26～28ku特异性scFv的获得,为进一步筛选、分析鉴定抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗SIEA26～28ku的编码基因奠定了基础.

肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的表达

为探讨一株肝细胞癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因在大肠杆菌中的可溶性表达策略并比较二者对抗原的结合能力,在三种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究,表达产物均以包涵体形式存在;对复性后的单链抗体以细胞ELISA及竞争抑制流式细胞仪法进行检测,表明人源化单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是:在大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定;先前的设计所采取的人源化方案没有影响到鼠源抗体的CDR的天然构象。

人源化抗Cry1B毒素蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定

利用含有重组噬菌粒的噬菌体直接侵染大肠杆菌(Escherichia coli)HB2151,原核分泌表达了抗苏云金芽孢杆菌(Ba-cillus thuringiensis,Bt)Cry1B毒素蛋白的单链抗体(single chain-variable fragment,scFv),经纯化、鉴定抗原结合活性后,建立了Cry1B毒素蛋白的ELISA检测方法。方法以展示scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB2151,经PCR和基因测序检测克隆scFv基因片段的完整性,用SDS-PAGE方法检测scFv在E.coli HB2151宿主菌中的表达水平,用ELISA测定法检测scFv的抗原结合活性,通过时间梯度优化获得可溶性表达蛋白的最佳培养时间。结果表明:经PCR、DNA电泳及基因测序等,均证实重组噬菌体对E.coli HB2151宿主菌侵染成功,SDS-PAGE电泳结果表明scFv抗体表达成功,纯化后的蛋白质量浓度为132μg.mL-1。以纯化的scFv蛋白为基础建立了对Cry1B毒素蛋白的间接竞争ELISA法,方法的抑制中质量浓度(IC50)为1.398μg.mL-1,最低检测限(IC10)为0.025 7μg.mL-1,线性检测范围为0.5～5.0μg.mL-1,scFv对Cry1C的交叉反应率为7.51%;与Cry1Ab、Cry1Ac的交叉反应率均小于0.1%;在培养温度30℃,1 mmol.L-1IPTG诱导条件下,scFv在E.coliHB2151宿主中的最佳诱导表达时间为12 h。本研究成功地将抗Cry1B毒素蛋白的scFv在E.coli HB2151中进行了可溶性表达,获得了具有抗原结合活性的scFv融合型抗体,为实际生产应用与试剂盒研发提供了基础。

人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的表达和鉴定

目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测。方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,用快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测表达产物的中和活性。结果Western blot显示表达产物与抗C-myc抗体在相对分子质量约30 000处出现强阳性表达带。FACS表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染的Vero细胞出现特异性反应。RFFIT表明,A12 ScFv在1∶27倍稀释时能完全中和病毒。结论已获得了A12可溶性表达,表达产物能与狂犬病毒G蛋白特异性结合,并对狂犬病毒具有一定的中和活性。

具有GPX活性单链抗体的制备及其抗氧化效应

为实现单链抗体的可溶性表达,制备具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力的单链抗体,在单链抗体表达载体pTMF 2F3上去除原2F3基因N端非必需的18个氨基酸,采用新的表达载体pRose质粒,在2F3的N端引入13个氨基酸的前导肽,转入BL21(lysS)中,使其分泌到大肠杆菌的周质腔中得以表达,获得可溶性表达产物.产物经过分离纯化、WesternBlot印迹和硒化测活确定具有GPX活性的鼠单链抗体,其GPX活力为2530U/μmol.以脂质过氧化、细胞存活率和细胞膜完整性为指标的抗氧化实验研究表明,具有GPX活性的单链抗体对大鼠乳鼠表皮细胞有抗紫外线损伤的作用,是膜脂质过氧化的有效抑制剂.

单链二硫键稳定抗体靶向超抗原SEA(D227A)分子的表达、纯化及鉴定

目的:提高抗肝癌靶向超抗原SEA(D227A)的产量和稳定性,构建单链二硫键稳定抗体靶向超抗原分子scdsFv-SEA(D227A)。方法:构建scdsFv SEA(D227A)表达质粒,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21plusS表达。包涵体经洗涤和复性后,用QSepharoseHP和Hiprep26/60SephacrylS-200HR纯化。纯化蛋白经AMS烷化处理并结合PAGE电泳来检测二硫键形成情况,并通过ELISA和MTS分别检测重组蛋白与肝癌细胞的结合活性、稳定性和细胞杀伤活性。结果:重组蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。通过复性及QSepharoseHP离子交换柱和Hiprep26/60SephacrylS-200H凝胶过滤两步纯化后,获得目的蛋白,每升诱导菌液的产量高达60mg。活性测定结果表明,相比与单链抗体靶向超抗原和二硫键抗体靶向超抗原SEA,二硫键抗体靶向超抗原在不影响结合活性和杀伤效果的情况下,稳定性有了较大提高。结论:建立了一种新的稳定的免疫毒素和提高其产量的方法,为hscFv25抗体靶向超抗原的临床应用奠定了基础,同时为其他低稳定性或低产量抗体的改造提供了借鉴的方法。

抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26～28kDa单链抗体与EGFP的融合表达及靶向性研究

目的体外观察抗日本血吸虫生殖功能分子SIEA26-28kDa单链抗体与日本血吸虫各阶段的靶向部位，探讨单链抗体在抗血吸虫病疫苗研究中的应用价值。方法扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因．克隆至PET32a／SIEA26～28kDa-scFv质粒，构建PET32a／EGFP-scFv质粒。转化至感受态E．coli BL21（DE3）中。并诱导表达单链抗体融合蛋白。分析单链抗体融合蛋白与SIEA26～28kDa的结合特异性。单链抗体融合蛋白与日本血吸虫成虫、虫卵切片孵育，荧光显微镜下观测GFP信号。确定特异性单链抗体的靶向性。结果重组质粒PET32a／EGFP-scFv构建成功．Trx-EGFP-scFv融合蛋白高效表达．与SIEA26-28kDa特异性结合。GFP信号主要集中在未成熟卵卵胚．雌虫卵巢、卵黄腺及与生殖系统邻近的肠腔组织。结论SIEA26-28kDa单链抗体与血吸虫未成熟卵胚胎及雌虫生殖系统具有较强的靶向性，具有潜在抗卵胚发育、抗雌虫生殖作用，为SIEA26-28kDa单链抗体在抗日本血吸虫病疫苗免疫靶向方面的研究奠定了基础。

抗骨肉瘤细胞系MG63特异性单链抗体的制备及功能鉴定

目的从全人源噬菌体抗体库中筛选与人骨肉瘤细胞MG63特异性结合的单链抗体（scFv）并进行表达、纯化及鉴定。方法采用噬菌体表面展示技术,以正常人成骨细胞系hFOBl.19为阴性筛选细胞,人骨肉瘤细胞系MG63为阳性筛选细胞,经过＂吸附-洗脱-扩增＂过程筛选并富集特异性抗体,ELISA检测并进行PCR扩增及测序鉴定。获得的阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151,IPTG诱导后经镍亲和层析柱纯化,用SDS-PAGE鉴定表达、纯化效果,ELISA检测可溶性特异性单链抗体的亲和力、特异性及稳定性。MTT法检测纯化后的单链抗体对骨肉瘤细胞MG63增殖的影响。结果通过筛选、PCR扩增和序列分析确定scFv4的片段包含免疫球蛋白序列,其表达产物可与抗原结合;纯化后的单链抗体对骨肉瘤细胞MG63增殖有明显的抑制作用,且其抑瘤作用与质量浓度成正相关。未加蛋白保护剂的纯化抗体4℃下其抗体活性可保持约5周,添加蛋白保护剂的纯化抗体则可在4℃下保持6-7周。结论利用噬菌体表面展示技术成功筛选出能与人骨肉瘤细胞MG63特异性结合的scFv,在大肠杆菌中成功表达并获得基因序列,抗体能抑制MG63细胞的增殖且稳定性良好。

抗CD5单链抗体融合毒素的研究

免疫毒素是目前导向药物研究的一个活跃领域，以抗ＣＤ５抗体为导向的免疫毒素可应用于自身免疫性疾病、淋巴性细胞瘤、淋巴性细胞白血病的治疗及器官移植和骨髓异体移植的辅助治疗中。作者将抗ＣＤ５单链抗体基因与绿脓杆菌外毒素ＰＥ４０和ＰＥ３５基因融合，表达出抗ＣＤ５单链体融合毒素。作者从分泌抗ＣＤ５单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取ｍＲＮＡ，ＲＴ－ＰＣＲ扩增出抗体ＶＨ和ＶＬｃＤＮＡ双链，组装成单链抗体基因，插入到噬菌粒ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ上，进行噬菌体表面呈现。用表达细胞表面抗原ＣＤ５分子的Ｍｏｌｔ－４细胞，对呈现单链抗体的重组噬菌体进行二轮富集、筛选，克隆阳性率超过１０％。通过细胞一ＥＬＩＳＡ法鉴定，选出４株高亲和力的克隆。ＤＮＡ序列分析表明单链抗体全长７３２个碱基，其中ＶＨ为３３９碱基，ＶＬ为３００ｂｐ，属于鼠的抗体家族。单链抗体基因在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ２１５１中进行可溶性表达，表达产物主要分布于周质之中，占周质蛋白的２０％～２５％。绿脓杆菌外毒素（ＰＥ）截去细胞结合活性结构域即为ＰＥ４０，它保留了跨膜转运功能和ＡＤＰ糖基化酶活性。进一步缺失３６５～３８０残基的重组毒素为ＰＥ３５。将单链抗体基因分别与ＰＥ４０与ＰＥ３５ＤＮＡ?

抗甲状腺刺激性免疫球蛋白单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的 制备可溶性抗甲状腺刺激性免疫球蛋白 (TSI)单链抗体。方法 构建的抗TSI单链抗体可溶性表达载体 ,转化E .coliXL 1-blue进行表达 ,表达产物经SDS -PAGE、Westernblotting和ELISA检测 ,同时对表达条件作了初步探索。结果 抗TSI单链抗体可溶性表达于细菌培养上清和周质间隙 ,大小约 30KDa ,具有抗TSI活性。温度、诱导物浓度及蔗糖对抗TSI单链抗体的表达产量有一定影响。结论 抗TSI单链抗体可溶性表达成功 。

乙肝病毒核心蛋白人源单链抗体在大肠杆菌中的表达

目的获得可溶性的抗乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（core ）的人源单链可变区抗体（ScFv），为得到纯度高、活力强的HBc-ScFv和进一步的抗HBV 治 疗奠定基础。方法采用噬菌体表面展示技术，以重组的HBV核心蛋白为包 被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程，获得抗原 结 合活性较强的乙型肝炎核心蛋白人源单链可变区抗体ScFv 片段克隆，并对其进行DNA序列及 免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化大肠杆菌HB2151，IPTG诱导表达乙型 肝炎核心蛋白可溶性人源单链可变区抗体，ELISA和western blot检测其抗原结合特异性。 结果克隆了乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体基因；经DNA酶切和序列 分析表明，该抗体基因由771个碱基组成；ELISA 和western blot结果表明：在大肠杆菌HB2 151中经IPTG诱导表达的可溶性乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体，具有结合乙型肝炎核 心蛋白的特异性和免疫活性。结论克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表 达了可溶性的HBc-ScFv。