制备可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白的两种细胞培养工艺比较

利用7．5L生物反应器篮式贴壁培养和全悬浮批式培养CHO工程细胞株表达可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部（sTNFRII-gAD）融合蛋白，比较这两种培养方法的产率，以便优化高效表达sTNFRII—gAD融合蛋白的制备工艺。篮式贴壁培养首先小规模培养CHO工程细胞株，待细胞增殖到一定密度后以3×105-4×10^5cells／mL密度接种生物反应器贴壁培养3d，调换成不含血清的LK021培养基继续培养4d。而全悬浮无血清批式培养则以3×10^5-4×10^5cells／mL密度的CHO工程细胞株接种于生物反应器，连续培养7d。培养过程实时监测培养条件，维持pH和DO的稳定。分别收集细胞上清，离心去细胞后用Pellicon切相流超滤系统对蛋白进行浓缩，并通过DEAE离子交换柱进行纯化。结果显示，篮式贴壁培养和全悬浮批式培养均成功表达了sTNFRII-gAD融合蛋白，产量分别为8．0mg／L和7．5mg／L、纯度分别为95％和98％，从而为sTNFRII-gAD融合蛋白的中试工艺研究提供了一定的基础。

重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对中重度银屑病患者血清脂肪因子水平的影响:前瞻性非随机对照试验

目的分析注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对中重度斑块型银屑病患者血清脂联素(adiponectin,APN)、视黄醇结合蛋白4 (retinol binding protein 4,RBP4)、瘦素(leptin,LEP) 3种脂肪因子水平的影响。方法选取2016年11月至2018年5月在北京协和医院皮肤科就诊的30例中重度斑块型银屑病患者作为治疗组,同时选取在本院健康医学部进行体检的25名健康人作为健康对照组。治疗组均给予重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白50 mg皮下注射,每周1次,共12次。检测健康对照组及治疗组治疗前(基线)和治疗后12周血清APN、RBP4、LEP的浓度;分析两组之间以及治疗组治疗前后血清脂肪因子水平是否存在差异,并采用Spearman相关分析法评估治疗组基线血清APN、RBP4、LEP表达水平与银屑病皮损面积和严重程度指数(psoriasis area and severity index,PASI)之间有无线性相关关系。结果治疗组基线APN水平[9. 73(6. 69,12. 37)比(14. 25 (10. 53,23. 28),P <0. 001]、LEP水平[0. 42 (0. 17,2. 60)比3. 90 (1. 38,7. 20),P=0. 002]较健康对照组降低, RBP4较健康对照组升高[12. 29 (10. 62, 21. 33)比9. 13 (7. 36,15. 78),P=0. 024];治疗组治疗后APN水平[11. 95 (8. 12,15. 26)比9. 73 (6. 69, 12. 37), P=0. 027]、LEP水平[2. 84 (1. 04,9. 34)比0. 42 (0. 17,2. 60),P<0. 001]较治疗前明显升高,而RBP4水平较治疗前差异无统计学意义(P=0. 125);基线APN、RBP4、LEP浓度均与PASI无线性相关关系。结论脂肪因子可能参与了银屑病的慢性炎症过程,抗肿瘤坏死因子α治疗可能改善银屑病的炎症状态。

可溶性肿瘤坏死因子受体II-脂联素球部融合蛋白的真核表达及生物学活性检测

本研究设计和构建了一种人肿瘤坏死因子受体II胞外区与人脂联素球部的融合基因sTNFRII-gAD,且相应的融合蛋白在哺乳动物细胞BHK-21S的无血清培养体系中实现了表达,并对该融合蛋白进行了初步鉴定。首先,用RT-PCR方法从人的外周血淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子II型受体胞外区基因片段,与脂联素球部基因片段融合,克隆至pAAV2neo表达载体中,构建成pAAV2neo-sTNFRII-gAD。随后,用pAAV2neo-sTNFRII-gAD转染BHK-21S细胞获得G418抗性细胞BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD;然后,将原来含有血清的培养液换成无血清的化学成分限定的培养液,细胞从贴壁培养方式转换成悬浮培养方式;最后,收集BHK-21S/pAAV2neo-sTNFRII-gAD无血清悬浮培养24h后的培养上清,进行sTNFRII-gAD融合蛋白的鉴定分析。酶切鉴定和测序结果显示,所构建的pAAV2neo-sTNFRII-gAD质粒结构正确,sTNFRII-gAD序列与预期一致;分别用抗人肿瘤坏死因子受体II和抗人脂联素球部的单克隆抗体检测pAAV2neo-sTNFRII-gAD瞬时转染的BHK-21S细胞,免疫荧光呈现阳性;免疫印迹分析在pAAV2neo-sTNFRII-gAD稳定转染的BHK-21S细胞上清中检测到sTNFRII-gAD融合蛋白的表达,并以单体、三聚体和三聚体以上的多聚体形式存在。活性测定结果表明,sTNFRII-gAD融合蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。因此,本研究为下一步大量制备sTNFRII-gAD融合蛋白用于体内外功能研究提供了良好基础。

注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对强直性脊柱炎患者血清DKK-1及骨代谢指标的影响

目的:观察注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白对强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)患者血清Dickkopf-1蛋白(DKK-1)及骨代谢指标的影响。方法:选取2016年12月至2018年6月华中科技大学同济医学院附属普爱医院诊治的40名AS患者为AS组,另选取同期40名健康体检者为对照组,所有AS患者均接受注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白25 mg、每周2次皮下注射治疗,疗程24周。比较2组患者外周血清DKK-1、骨代谢指标[骨钙素(osteocalcin, OC)、Ⅰ型胶原氨基端前肽(aminoterminal propeptide of type 1 collagen, PINP)、Ⅰ型胶原交联C端肽(C-terminal cross-linking telopeptide of type 1 collagen, CTX-1)]、红细胞沉降率(ESR)和C-反应蛋白(CRP)水平。比较AS组患者治疗前及治疗24周后疾病活动度、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、DKK-1、骨代谢指标、ESR及CRP水平。分析AS组患者DKK-1及骨代谢指标与疾病活动度、ESR及CRP的关系。结果:AS组患者血清DKK-1水平明显低于对照组(P<0.01),CTX-1、OC及PINP水平高于对照组(P<0.01)。AS组患者治疗24周后,CTX-1、TNF-α、BASDI、ESR及CRP水平均较治疗前明显下降(P<0.01),而DKK-1、IL-6、OC及PINP变化不明显(P>0.05)。AS组患者血清CTX-1水平与ESR、CRP、 BASDI水平呈正相关关系,而DKK-1、OC、PINP水平与ESR、 CRP、 BASDI水平无相关性。结论:AS患者存在骨代谢的紊乱;DKK-1参与AS新骨形成;注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白能有效控制AS炎症,改善骨代谢,但不能上调DKK-1的表达。

sTNFRII-gAD-Fc融合蛋白在CHO细胞中的高效表达

构建了人肿瘤坏死因子受体II胞外区、人脂联素球部与人IgG1 Fc的融合基因sTNFRII-gAD-Fc的真核表达载体,在CHO-S细胞中快速高效表达,探索了无血清悬浮流加培养工艺。应用重组PCR将人IgG1 Fc基因片段与sTNFRII-gAD基因片段融合,构建pMH3-sTNFRII-gAD-Fc表达载体,电转染至CHO-S细胞,挑选G418抗性的高表达单克隆,斑点杂交半定量分析和Western blot分析sTNFRII-gAD-Fc的表达,Protein A-Agarose纯化,以及拮抗TNFα的生物活性测定。最后在摇瓶、转瓶及生物反应器中进行了逐级放大的无血清悬浮批次及流加培养,即:2.0 &#215;106 cells/mL的接种密度,当达到4.0 &#215;106 cells/mL以上时开始流加培养并以每日葡萄糖的残余量2 g/L左右作为流加体积的控制参数。成功构建pMH3- sTNFRII-gAD-Fc表达载体,检测到sTNFRII-gAD-Fc在CHO-S细胞培养上清中以二聚体和多聚体形式表达,获得了高表达(75 μg/mL)单克隆细胞株,且该蛋白具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性。在摇瓶中无血清批次培养和转瓶及生物反应器中流加培养时产量分别为10.0 mg/L、18.3 mg/L和20.5 mg/L。利用CHO-S细胞系统成功实现了sTNFRII-gAD-Fc 融合蛋白的快速高效表达,为建立一套高密度、高效表达该融合蛋白的悬浮流加培养中试工艺打下了良好基础。