可溶性转氢酶促进链球菌异柠檬酸脱氢酶基因表达的研究

目的构建携带E．coli可溶性吡啶核苷酸转氢酶（UdhA）基因的双启动子双基因表达载体，鉴定此载体系统对表达效率不高的链球菌异柠檬酸脱氢酶（SmIDH）的促进表达。方法PCR法扩增SmIDH基因，插入pBluescript ⅡSK（＋）得表达载体pSX。从E．coli基因组扩增UdhA基因，插入pBluescriptⅡSK（＋），构建表达载体pUX。再用以pUX为模板PCR扩增lac启动子和udM基因片段，插入pSX中，获得双启动子双基因表达载体pUS。IPTG诱导表达，SDS—PAGE鉴定SmIDH的表达。结果酶切证实UdhA和SmIDH双基因正确克隆到pBluescriptⅡSK（＋）中，序列测定显示双基因与GenBank报道一致及两个lac启动子方向相同，并且初步的表达实验证明UdhA促进了SmIDH的表达。结论UdhA的表达促进了SmIDH基因的表达，为该表达策略的通用性研究奠定了基础。

吡啶核苷酸转氢酶的结构及功能

吡啶核苷酸转氢酶(pyridine nucleotide transhydrogenases)是能直接催化NADP(H)与NAD(H)之间氢负离子可逆转移的氧化还原酶,主要调控分解代谢和合成代谢过程中NADH与NADPH之间的动态平衡.膜结合吡啶核苷酸转氢酶(TH)是ATP依赖性跨膜蛋白,由2个亚基构成,每个亚基包含dⅠ、dⅡ和dⅢ三个结构域.在TH结合可变催化机制中,氢负离子的转移总是与质子转移相偶联.可溶性吡啶核苷酸转氢酶(STH)是非能量依赖性的黄素蛋白,以可溶性多聚体形式存在.目前认为,很多因活性氧自由基异常增多而引起的线粒体疾病都与TH的活性有关,包括糖尿病、癌症、神经退行性疾病及心血管疾病等.TH分子机制的研究将有助于揭示这些线粒体疾病的致病机理以及为其诊断和基因治疗提供分子依据.STH作用机理的研究及其在辅酶再生系统中的应用,将会推动代谢工程和工业生物催化过程的进一步发展.