基因工程可溶性MHC分子的研究和应用

为了揭示TCR-抗原肽-MHC三元复合体的识别模式,利用基因工程技术构建的可溶性MHC分子,为此提供了有利工具。可溶性单链MHC分子具有与穿膜型分子相类似的功能,在体外已成功地应用于TCR与MHC分子之间的识别动力学研究及三维空间结构研究,并可能作为一种免疫调节分子起到治疗疾病作用。

可溶性MHCⅡ类分子四聚体的制备及其应用

可溶性MHCⅡ类分子四聚体可被用于计数、分离CD4+T细胞以及分析其生物学性状,而且MHCⅡ类分子四聚体在制备、标记和应用方面显示出与MHCⅠ类分子四聚体明显不同的特点,是探索自身免疫性疾病的发病机理和筛选T细胞肽表位(tetramerguidedepitopemapping,TGEM)时必不可少的工具。

重组可溶性MICA蛋白负调控NK细胞对白血病细胞的杀伤活性

目的:体外研究重组可溶性MHCⅠ类分子相关A(soluble MHC classⅠchain-related gene A,sMICA)蛋白对自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)表面活化性受体NKG2D(natural killer group 2 member D)的表达、杀伤白血病细胞的活性和分泌IFN-γ的影响。方法:免疫磁珠分选健康人外周血NK细胞,分为空白对照组、重组sMICA组(200、500、800μg/L三亚组),相互作用24 h后,流式细胞术检测NK细胞NKG2D表达水平,LDH释放法检测NK细胞对白血病细胞K562的杀伤活性,ELISA法检测培养上清中IFN-γ的水平。结果:200、500、800μg/L sMICA作用组与对照组相比,NK细胞表面NKG2D的表达均下调[(68.79±6.87)%,(55.75±9.31)%、(45.14±5.70)%vs(92.75±6.91)%,P<0.05或P<0.01],均抑制NK细胞杀伤白血病细胞K562的活性[(18.67±2.35)%、(15.01±2.25)%、(7.33±2.52)%vs(36.33±2.51)%,P<0.05或P<0.01],均抑制IFN-γ的分泌[(164.48±22.48)、(112.71±10.89)、(70.23±9.64)vs(313.72±16.06)pg/ml,P<0.05,P<0.01]。结论:急性白血病细胞表面脱落的sMICA可下调NK细胞NKG2D的表达和IFN-γ的分泌,抑制了NK细胞对白血病细胞的杀伤活性。

非小细胞肺癌患者的血清sMICA水平及临床意义

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清中可溶性MHCⅠ类链相关分子A(sMICA)的水平及临床意义。方法采用酶联免疫吸附法检测本院2013年1月至2017年12月的65例初诊NSCLC患者和50例体检健康者以及40例化疗后可评价疗效NSCLC患者的血清sMICA水平,实时定量PCR检测12例手术或支气管镜活检肺癌组织和5例来源于肺大泡患者正常肺组织的MICA水平并分析组织MICA水平与血清sMICA水平的相关性,根据随访数据分析血清sMICA水平与预后的关系。结果NSCLC患者的血清sMICA水平为(127.2±25.7)ng/L,高于体检健康者的(57.2±26.7)ng/L(P<0.05)。25例Ⅰ~Ⅱ期患者的血清sMICA水平为(109.6±25.4)ng/L,低于40例Ⅲ~Ⅳ期患者的(136.2±23.6)ng/L(P<0.05);38例肺鳞癌患者的血清sMICA水平为(128.8±23.8)ng/L,与27例肺腺癌患者的(135.2±22.9)ng/L相比差异无统计学意义(P>0.05)。40例NSCLC患者通过化疗后,33例化疗有效者的血清sMICA水平为(72.5±29.7)ng/L,低于化疗前的(139.2±24.9)ng/L(P<0.05),而7例化疗无效者的血清sMICA水平为(153.2±35.2)ng/L,较化疗前(131.2±16.7)ng/L的差异无统计学意义(P>0.05)。NSCLC患者的血清sMICA水平与肺癌组织的MICA水平无关(r=0.131,P=0.685)。血清sMICA低水平组的中位总生存期为1185天,优于高水平组的984天(P<0.05)。结论NSCLC患者的血清sMICA水平升高且与患者的治疗反应和预后有关,但与肺癌组织的基因表达无关。监测患者外周血清中sMICA水平有助于NSCLC临床诊断和疗效评估。

非小细胞肺癌血清sMICA、microRNA-99a、DJ-1表达及临床意义

目的 分析血清可溶性MHCⅠ类链相关分子A(sMICA)、microRNA-99a、DJ-1蛋白(DJ-1)对非小细胞肺癌(NSCLC)诊断及预后评估价值。方法 收集2019年6月至2022年6月本院收治的NSCLC患者90例(NSCLC组),另选取本院同期健康体检志愿者90例(对照组)。对患者进行为期6个月随访,随访截止至2023年1月。采用ROC曲线评估sMICA、microRNA-99a、DJ-1对NSCLC诊断价值。采用多元Logistic回归分析影响NSCLC患者预后的关系。结果 NSCLC组sMIC、DJ-1表达水平高于对照组,microRNA-99a表达水平低于对照组(P<0.05);ROC曲线结果显示:sMICA、microRNA-99a、DJ-1对NSCLC诊断AUC值分别为0.742(95%CI:0.642~0.842)、0.759(95%CI:0.660~0.859)、0.789(95%CI:0.698~0.901)。90例患者中预后良好69例,预后不良21例。预后不良者sMIC、DJ-1表达水平高于预后良好组,microRNA-99a表达水平低于预后良好组(P<0.05);预后不良者TNM分期(III-IV期)、低分化占比高于预后良好组(P<0.05);两组在年龄、性别、肿瘤直径、病理类型中比较差异无统计学意义(P>0.05)。经多元Logistic回归分析:临床分期、分化程度、sMICA、microRNA-99a、DJ-1为影响NSCLC患者预后不良的危险因素(P<0.05)。结论 相对健康人群,NSCLC患者sMICA、DJ-1水平高,microRNA-99a水平低;三指标水平与患者预后密切相关,通过检测血清三者水平可为患者后续诊疗、预后评估提供参考资料。

敲低TFAM通过上调ROS/ADAM17促进可溶型MICA生成抑制NK细胞杀伤人肝癌细胞的作用

目的探索线粒体转录因子A(TFAM)表达下调促进肝癌细胞逃避自然杀伤(NK)细胞的作用及机制。方法免疫组织化学染色法检测肝癌及癌旁组织中TFAM的表达,分析肝癌组织中TFAM表达水平与肝癌患者临床参数及预后的相关性。利用慢病毒载体构建TFAM稳定干涉及过表达的肝癌细胞株,与NKL细胞共培养,ELISA检测培养上清中可溶性MHCⅠ类链相关分子A(sMICA)水平及NK细胞活化相关细胞因子的变化;流式细胞术检测肝癌细胞膜MICA的水平;乳酸脱氢酶(LDH)释放试验检测共培养的NKL细胞杀伤活性。调控共培养上清中sMICA的含量后,ELISA及LDH试验检测细胞因子及NKL细胞杀伤功能是否受到影响。调控TFAM干涉或过表达肝癌细胞内的活性氧(ROS)水平和解整合素金属蛋白酶17(ADAM17)表达,ELISA检测sMICA变化。结果与癌旁组织相比,TFAM在肝癌组织中显著低表达,且TFAM低表达肝癌患者其总生存期和无病生存期均显著低于TFAM高表达肝癌患者。敲低肝癌细胞TFAM后,细胞膜型MICA水平显著降低,而培养上清中的sMICA显著增加,细胞内ROS水平及ADAM17的表达均显著增强;肝癌细胞过表达TFAM后则相反。将TFAM稳定干涉的肝癌细胞与NKL细胞共培养后可显著降低NKL细胞活化细胞因子的分泌及杀伤功能,反之,与TFAM过表达的肝癌细胞与NKL细胞共培养后其活化相关细胞因子的表达及杀伤功能均显著增强。在肝癌细胞与NKL细胞共培养上清中加入MICA中和抗体,可显著恢复肝癌细胞TFAM干涉所导致的NKL细胞活性抑制及杀伤功能减弱;在共培养上清中加入重组MICA后,TFAM过表达所致的NK细胞活化及杀伤功能增强被显著抑制。敲低TFAM引起sMICA生成增加,但中和ROS或者敲低ADAM17后,可显著抑制sMICA生成;TFAM过表达导致sMICA生成减少,加入过氧化氢(H2O2)或者过表达ADAM17后,可显著增加sMICA生成。结论敲低TFAM上调ROS/ADAM17通路促进sMICA生成,抑制NK细胞的杀伤力。

可溶性H-2K^b与绿色荧光蛋白融合基因的构建及其在COS7中的表达

本文应用基因工程技术构建了可溶性H 2Kb 分子与绿色荧光蛋白 (GFP)融合基因sKb GFP。在COS7细胞中表达后 ,在内质网区域呈现明显绿色荧光。RT PCR结果显示融合基因获得了正确表达 ,蛋白印迹分析表明细胞内产生了预期大小的融合蛋白。细胞培养上清经亲和层析柱纯化后 ,获得了预期大小的重组蛋白。