膜吸附法结合可视化环介导等温扩增技术检测柑橘黄龙病菌

【背景】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等。前3种方法都需要依靠准确的柑橘黄龙病诊断技术。【目的】利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),结合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen荧光染料可视化,建立黄龙病田间核酸快速检测方法。【方法】以黄龙病菌β-操纵子与原噬菌体DNA聚合酶基因为模板设计LAMP特异性引物,包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LoopF/LoopB和茎引物StemF/StemB。通过对环引物和茎引物设定不同的用量组合,对LAMP引物体系进行优化,确定合适的引物浓度。用优化后的LAMP引物体系对188份田间柑橘叶片进行检测,并构建受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析实时荧光LAMP(qLAMP)在CLas检测上的准确性。对qLAMP预混反应液进行两步的常温干燥,分别设定不同的存放条件,评估LAMP常温干燥试剂的稳定性。用本研究建立的CLas可视化LAMP快速检测方法,对田间71个柑橘叶片样品和35个柑橘果实样品进行检测,与实时荧光定量PCR(qPCR)比较两者的符合率。【结果】在LAMP体系中加入环引物、茎引物或增加其浓度都能促进反应速率的提升,并且同时加入终浓度均为1.6μmol·L-1的环引物和茎引物能进一步提高LAMP反应速率。LAMP预混液通过两步法干燥在不同温度存放1—4周均能保持反应活性基本不变,表明制备的两步法干燥LAMP试剂检测性能较好,在低温和常温环境下的稳定性尚可,仅35℃高温存放会略微增加LAMP试剂的反应时间。使用孔径0.1μm尼龙膜代替纤维素滤纸作为核酸吸附材料能提升CLas快速诊断技术的灵敏度。结合DNA快速提取和可视化LAMP建立的CLas快速核酸诊断方法最低能检测到浓度为102 copies/μL的重组质粒样品,总体准确率高。经配对卡方检验,该方法的诊断结果与qPCR无显著差异。可视化LAMP快速检测相较常规检测有着更低的成本和耗时,而且可视化LAMP快速检测无需离心机和PCR仪等昂贵的仪器,仅需一台65℃恒温设备即可。【结论】建立的CLas快速核酸检测方法成本低,30 min即可观察到检测结果,操作简便,准确性高,可替代qPCR在田间进行黄龙病的快速鉴定。

可视化环介导等温扩增技术在肺炎支原体检测中的应用

目的建立可视化肺炎支原体环介导等温扩增(LAMP)检测体系,并对其敏感性和特异性进行验证,以期开发出适合各级医院和现场高通量检测的肺炎支原体试剂盒。方法克隆肺炎支原体P1基因质粒,并以此为模板建立LAMP体系,优化肺炎支原体LAMP体系的各组分和反应参数,添加反应指示剂羟基萘酚蓝,用已知浓度的肺炎支原体P1质粒检测体系敏感性;以相近种类支原体和细菌检测体系特异性。结果建立的可视化肺炎支原体LAMP体系能特异性检测肺炎支原体,检测限为2×102copies/m L。结论建立的可视化肺炎支原体LAMP检测体系可应用于人肺炎支原体检测,价格低廉,无需贵重仪器设备,操作简便,适合各级医院和现场高通量肺炎支原体检测。

基于可视化环介导等温扩增技术快速、灵敏检测瓜类蔓枯病菌

目的与意义:蔓枯病(gummy stem blight,GSB)是葫芦科作物(比如哈密瓜、香瓜、黄瓜和西瓜等)的世界性病害,往往危害茎和叶,且通过温室育苗和修剪被侵染植株而交叉感染传播,也可通过种子带菌传播.在有利的环境条件下,低水平的潜在侵染苗有可能导致病害大流行.大棚内的高湿环境有利于瓜类蔓枯病发生,己成为瓜类生产中继枯萎病之后最严重的病害之一.蔓枯病菌(Didymella bryoniae)是导致葫芦科作物蔓枯病的病原,蔓枯病菌的早期诊断、灵敏、快速的检测对于限制蔓枯病在温室育苗或田间移栽的传播具有重要意义.本研究基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP),建立可视化、快速、灵敏的瓜类蔓枯病菌检测体系.

基于可视化环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)建立基于颜色判定的快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法.根据金黄色葡萄球菌特异性靶基因SAR0395设计LAMP引物,建立可视化LAMP检测方法.优化的反应体系为:1.6μmol/L内引物(FIP和BIP),0.2μmol/L外引物(F3和B3),4.0 mmol/L MgSO4,1.0 mmol/L dNTPs,0.4 U/μL Bst 2.0 WarmStartTMDNA聚合酶,120μmol/L羟基萘酚蓝,扩增温度60℃,扩增时间60 min.在可视化LAMP体系中添加两条环引物(LF和LB)反应时间可缩短至20 min.该可视化LAMP反应60 min,其基因组灵敏度可以达到0.0103 fg/μL,菌落灵敏度可以达到1.9 CFU/mL;利用46株金黄色葡萄球菌和24株非金黄色葡萄球菌证实该可视化LAMP具有良好的特异性和可靠性.本研究中建立的可视化LAMP可为金黄色葡萄球菌的快速检测提供一种新的技术.

可视化环介导等温扩增技术检测鸡鸭源性成分

目的建立生肉及熟肉制品中鸡、鸭源性成分的特异性基因LAMP可视化快速检测方法。方法根据鸡鸭物种特异性cytb、COX3基因的6个特异性区域设计LAMP引物,在反应前加入羟基萘酚蓝(HNB),在63℃条件下反应45 min;反应结果可以根据颜色变化直接判断,阳性为天蓝色,阴性为紫罗兰色。并对30个肉制品样品进行可视化LAMP和PCR方法平行检测。结果 LAMP方法的最低检出限为1 pg,特异性良好,同时对肉制品中目标物检测的检出限可达到0.01%。结论该方法用于肉制品中鸡鸭源性成分的快速检测,具有操作简单、无需贵重仪器、反应结果肉眼可观察、灵敏度高和特异性强等特点,适合于基层监管部门进行肉制品现场快速检测。

可视化环介导等温扩增技术研究进展

环介导恒温扩增技术(LAMP)因扩增效率高设备简单极具应用价值,但其产物易污染环境致假阳性限制了其推广应用。LAMP产物分析技术经历了开放式凝胶电泳,封闭式显色,到免疫薄膜层析显色发展历程,污染问题逐步得到解决。

FTA-环介导等温扩增技术直接提取变异链球菌DNA的效果评价

背景:变异链球菌是龋病的重要病原菌,及时检测变异链球菌水平对龋病的早发现、早治疗有重要意义。目的:建立并评价FTA-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术直接提取变异链球菌DNA的应用效果。方法:①制备含有ATCC标准菌株变异链球菌的菌悬液,接种于脑心浸出液培养基,充分混匀后按10倍梯度稀释成7种浓度(4.2×10^(7),4.2×10^(6),4.2×10^(5),4.2×10^(4),4.2×10^(3),4.2×10^(2),4.2×10 CFU/mL),每个稀释级做2个平行对照,并增加无菌水作为空白对照;②分别采用FTA卡、常规煮沸法、试剂盒提取及裂解液提取4种方法直接提取菌株DNA,通过LAMP技术进行扩增,并进行特异性试验,比较4种提取方法的差异。结果与结论:①4种方法提取的DNA均满足LAMP扩增的要求;②特异性试验结果显示,只有变异链球菌才可特异扩增出靶基因;③裂解液提取法最低检测限为4.2×10^(3) CFU/mL,FTA卡提取法最低检测限为4.2×10^(4) CFU/mL,试剂盒提取法和常规煮沸法最低检测限分别为4.2×10^(6) CFU/mL和4.2×10^(7) CFU/mL;④4种提取方法其他方面的比较显示,试剂盒提取法的实验成本、步骤数和时间都是最高;其他3种方法步骤数一致,其中FTA卡所需仪器设备最少,常规煮沸法单次成本最低,裂解液提取法所需时间最少;FTA卡和裂解液提取法仅需少量菌即可提取成功,后者在时间方面优于FTA卡,但相较于FTA卡其单次成本高,所需设备多;⑤结果说明,该研究建立的FTA-LAMP技术具有操作简便、特异性强、灵敏度高、结果可视化等优势,有望为高效提取检测变异链球菌提供新途径。

肠道侵袭性大肠埃希氏菌可视化环介导等温扩增方法的建立

肠道侵袭性大肠埃希氏菌(Enteroinvasive Escherichia coli,EIEC)是一种重要的食源性致病菌,可引起人类肠道疾病。本研究建立可视化环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)方法,针对EIEC特异性基因ipaH设计引物,优化反应条件,并对该方法的特异性、灵敏度进行评估。结果显示,所建立的LAMP方法在63℃反应45 min后可凭肉眼或紫外光下观察判定结果,对EIEC的检测灵敏度可达10 pg·μL^(-1)。该方法特异性良好,与其他常见肠道致病菌,如沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应。本研究建立的可视化LAMP方法快速、灵敏度高、对设备要求低,可满足现场快速检测需求。

环介导等温扩增技术在病原微生物临床检测中的应用

病原微生物是威胁人类健康的重要因素之一,快速、准确的检测方法对于感染性疾病的诊断具有重要意义。环介导等温扩增(LAMP)是一种恒温扩增方法,具有反应时间短、操作简便、灵敏度高、特异度高、检测成本低等优点,因此被广泛应用于感染性疾病的快速诊断。基于这种情况,该文主要阐述了LAMP的原理、特点及其在临床常见病原微生物检测方面的应用与研究进展。LAMP技术现在已经被应用于病原微生物的检测,且具有较高的灵敏度及特异度,但该技术仍有易产生假阳性、引物设计复杂等不足之处。该文综述了近年来LAMP技术在病原微生物感染中的应用与进展,并对其未来的发展前景进行了展望,以期在资源有限的环境中为病原微生物感染的快速诊断提供合理的研究方向。

可视化-环介导等温扩增技术检测肠出血性大肠杆菌O157:H

目的建立可视化的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)联合横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)方法检测肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)0157:H7的分析方法。方法以EHEC 0157:H7的遗传标志性基因z3276基因序列为检测靶标设计6条LAMP特异性引物,其中2条环引物分别标记异硫氰酸荧光素和地高辛,用LFD检测扩增产物,建立EHEC0157:H7 LAMP-LFD检测方法。结果所建立的检测方法能够特异性的检测EHEC 0157:H7,与试验对照菌株EHEC 026、0145、045、0121,及其他主要大肠杆菌血清型025、078、0103、O111、0127、0138、0139、0141,及禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)E058、肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli,EPEC)SEC627、EPEC SEC689、K12-MG1655、BL21,和其他种属的受试菌,不存在交叉反应;对EHEC 0157:H7纯培养物的最低检测限为1.3 CFU/mL。结论本研究所建立的LAMP-LFD检测方法特异性和敏感性良好,操作简单,结果可视。

环介导等温扩增技术结合乳胶微球试纸条检测副溶血性弧菌

目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术结合乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)快速检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的方法。方法以副溶血性弧菌的不耐热溶血素(TLH)基因作靶标设计引物,6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,6-FAM)和生物素(Biotin)标记引物,对体系各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)和实时荧光定量LAMP(quantitative LAMP,qLAMP)反应,比较三者的敏感度;对副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、粪链(肠)球菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP-LMTS的可靠性。结果LAMP-LMTS方法的灵敏度可达4.16×10^(2)copies/μL,与qLAMP、LAMP-琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis,AGE)方法结果一致,检出限要比利用外引物建立的PCR方法低10倍的拷贝数,灵敏度更高。结论该方法检测副溶血性弧菌具有检测时间短、灵敏度高、特异性强、操作简便等特点,可应用于基层实验室、应急检测或现场监测,具有较高的推广价值。

基于nuc基因的环介导等温核酸扩增可视化技术检测食源性金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌食物中毒主要是由食用被金黄色葡萄球菌及其所产生的肠毒素污染的奶、肉、蛋、糕点、剩饭等蛋白或淀粉含量丰富的食品引起,快速精准的金黄色葡萄球菌检测技术对于保障人们的健康和食品安全具有重要意义。本研究以nuc基因作为检测靶基因,建立了一种检测金黄色葡萄球菌的环介导等温核酸扩增(LAMP)技术。该方法检测金黄色葡萄球菌基因组DNA样品为阳性,而对单细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌和产气荚膜梭菌等食源性致病菌和猪链球菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌等猪源细菌基因组DNA检测结果均为阴性,表明建立的LAMP方15法具有较好的特异性。灵敏度的检测结果表明,LAMP的检测限可达5.6×10^(1) CFU/mL,而常规PCR的检测限为5.6×10^(5) CFU/mL,即LAMP的检测灵敏度比常规PCR高出10000倍。临床样品的检测结果表明,50份猪肉样品中有4份检出金黄色葡萄球菌。本研究为食源性金黄色葡萄球菌提供了一种快速、可视化、特异性好、灵敏度高、成本低的LAMP检测方法。

环介导等温扩增技术及扩增产物分析方法的比较

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)自开发以来,以其操作简便、灵敏度高、特异性好、扩增效率高等优点得到广泛地研究,在细菌、病毒、寄生虫、转基因成分等检测和鉴定中发挥重要作用,检测样品涵盖食品、环境、医疗、动植物检疫鉴定领域。LAMP技术最大的优点之一是扩增产物分析方法简便快速、不需要特殊的设备,特别适合在基层检验机构和现场检验推广应用。随着分析方法的研究,LAMP技术与相关技术偶联,使得产物分析方法灵敏度大大提高,检测速度更快、更方便。该文对LAMP相关技术及LAMP扩增产物检测分析方法的研究进行比较与分析,以期为LAMP方法的应用和开发提供建议和方向。

基于环介导等温扩增技术的玫烟色棒束孢可视化检测

玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea是一种重要的虫生真菌,已成为微生物源农药的一个要资源。由于缺乏有效手段,无法对罹病害虫中玫烟色棒束孢进行大量、快速、准确的检测,严重制约了该生防菌株防治效果的科学评价。本研究通过环介导等温扩增(LAMP)技术的引物设计和体系优化,建立了玫烟色棒束孢菌株可视化的LAMP检测方法。该检测方法特异性强,准确率高,与其他常见生防菌株和病原菌无交叉反应;检测时间短,60 min可得到阳性结果;灵敏度高,是常规PCR方法的100倍。该方法的建立为田间条件下玫烟色棒束孢菌株的毒力测定与安全性评价提供了新技术。

环介导等温扩增技术可视化快速检测表皮葡萄球菌方法的建立

目的建立可视化环介导等温扩增(LAMP)检测方法,应用于表皮葡萄球菌的快速检测。方法针对表皮葡萄球菌的Ses B基因,选择特异性引物,建立环介导等温扩增体系。对反应的可视化方法、体系中的Mg SO4浓度、甜菜碱浓度、反应温度、反应时间进行优化。将优化好的LAMP反应和PCR反应的灵敏度和特异性进行比较。结果环介导等温扩增反应体系中最适MgSO4终浓度为4mM;最适甜菜碱浓度为0.4M;最适反应温度和时间为63℃,反应60 min;最适宜的可视化方法为钙黄绿素显色法且可视化结果与琼脂糖凝胶电泳结果基本一致;LAMP和PCR反应均具有较好的特异性,LAMP反应的灵敏度为10 copies/μL,PCR反应的灵敏度为100 copiesμL。结论LAMP钙黄绿素可视化检测表皮葡萄球菌感染优于普通PCR,操作简便且不需要昂贵检测设备,有望应用于基层和偏远贫困地区早期诊断。

布鲁氏菌环介导等温扩增(LAMP)可视化检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性,并对60份牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)阳性血清样本,经LAMP和B4/B5-PCR方法进行平行检测。结果显示,本方法最低检出限约为17fg布鲁氏菌基因组DNA。本方法特异性良好,布鲁氏菌反应管均出现特异性LAMP扩增反应,而猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。针对60份RBT阳性血清的平行检测结果显示,LAMP和B4/B5-PCR这两种方法间的结果符合率为85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品,经本方法检测全部为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的17份样品,经本方法检测,9份为阳性,8份为阴性。LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。实验表明,本文所建立的基于颜色判定的布鲁氏菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。

荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的对比研究

目的对比荧光定量核酸扩增检测技术与环介导等温扩增技术在呼吸道感染病原体检测中的应用价值。方法随机在2020年1月~2023年1月天津市河东区疾病预防控制中心接收的呼吸道感染的患者中选取120例作为研究对象,分别采用荧光定量核酸扩增(PCR)检测技术与环介导等温扩增技术(LAMP)检测呼吸道病原体,并对检测结果进行比较分析。结果120例患者中使用LAMP检出细菌感染85例(阳性率为70.83%)。荧光定量PCR检出细菌感染72例(阳性率60.00%),差异无统计学意义(P>0.05);其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法,差异有统计学意义(P<0.05);采用荧光定量PCR与LAMP法对呼吸道感染10种病原体进行检测,结果表明,除LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、流感嗜血杆菌的检测一致性极好,荧光定量PCR对耐甲氧西林葡萄球菌的检测一致性极好(Kappa≥0.75),其余病原体采用荧光定量PCR与LAMP法检测一致性均中等(0.4≤Kappa<0.75)。结论荧光定量PCR与LAMP两种检测方法对呼吸道感染病原体检出率均较高,其中LAMP法对耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于荧光定量PCR法。

环介导等温扩增技术用于消化道和呼吸道病毒检测的研究进展

消化道病毒包括肠道病毒、肝炎病毒和急性胃肠炎病毒等，可分别引起肝炎、急性胃肠炎和手足口病等疾病，呼吸道病毒是呼吸性疾病的一种病原体。据报道90％以上急性呼吸道感染是由呼吸道病毒引起的。在收集到的消化道和呼吸道标本中检测到相应病毒是诊断这类疾病的金标准，但通常阳性率较低，需要花费大量的物力和人力等资源；随后人们利用免疫学方法检测这些病毒刺激机体产生的循环抗原或循环抗体，尽管敏感性较高，但存在较多的假阳性；接着人们采用PCR方法检测这些病毒，敏感性和特异性有了较大的提高，但昂贵的PCR仪购置限制了它的广泛应用，研制新的病毒检测技术已迫在眉睫。

绵羊肺炎支原体环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测方法的建立

为建立绵羊肺炎支原体快速检测方法,用环介导等温扩增(LAMP)技术进行核酸扩增,通过横向流动试纸条(LFD)实现可视化检测。针对绵羊肺炎支原体HSP 70基因设计一套特异性引物,其中HSP70FIP由生物素标记进行LAMP扩增反应,产物与生物素标记的探针杂交后,在LFD上完成检测,建立了绵羊肺炎支原体LAMP-LFD快速检测方法,并对其特异性、敏感性及临床应用进行检测。结果表明,LAMP在62℃反应70min,即可特异性的检测绵羊肺炎支原体的存在,最低检测线为1.0×102 CFU/mL,灵敏度是常规PCR检测方法的100倍,且对已知感染绵羊肺炎支原体的羊病变肺组织临床样品的检出率为100%。建立的LAMP-LFD检测绵羊肺炎支原体的方法特异性强、灵敏度高并且操作简便,为羊感染绵羊肺炎支原体的预防和诊断提供了新方法。

环介导等温扩增技术在农业病害检测中的应用综述

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型核酸等温扩增技术,其原理是当温度为60~65℃时,DNA处于动态平衡状态,DNA双链打开,此时依赖Bst DNA聚合酶的链置换活性,使DNA可以在60~65℃的恒温下进行合成。其扩增引物是基于靶基因的6个特异性区域设计的,扩增阶段需要引物与样品DNA完全结合,才可以进行扩增,所以LAMP技术具有高特异性与高灵敏性。其反应温度恒定,不需要额外的控温设备,理想条件下仅需保温杯,即可进行DNA扩增。在田间检测时,只需提取样品总DNA,即可于田间进行病害检测,缩短了检测流程及时间,使病害检测更高效更便捷。在反应前或反应后加入特定染色剂,即可通过染色剂的变色情况进行反应结果的判定,使反应结果可视化。目前该技术已凭借其特异性高、灵敏性高、所用仪器简单(恒温水浴锅或保温杯即可)、检测效率高和检测结果可视化等优点,广泛应用于临床病原微生物检测、食品微生物检测、环境微生物检测、植物或微生物基因鉴定等领域。在农业病害的病原微生物(真菌、细菌、病毒、线虫)快速检测和诊断领域,已有很多研究针对各种病害建立了相应的LAMP检测技术。本文简要综述了LAMP技术原理、反应结果判定、优缺点和该技术目前在农业常见病原物检测中的应用,并对LAMP技术的应用前景进行了进一步的展望。