拉曼光谱研究表面活性剂对皮肤刺激和皮肤防护的体内分子机制

为了更好地研究表面活性剂对皮肤损伤和皮肤防护的分子机制,需要研究人(内源性物质和结构)、物质(刺激物和抗刺激活性物)、以及人与物质的相互作用。然而,在人体上分子水平的机制研究报道很少。共聚焦拉曼光谱可以开展此类研究,因其可以在体、实时和非侵入式地测定角质层中的某些内源性或外源性物质,并分析角质层结构。文章以十二烷基硫酸钠(SDS)作为刺激剂,通过共聚焦拉曼光谱扫描志愿者前臂屈侧皮肤12μm深度内,定性和半定量地测量SDS经皮吸收的相对量和深度,以及SDS“入侵”时皮肤脂质相对含量和结构的变化。结果表明,SDS经皮吸收进入角质层,导致角质层脂质流失和脂质有序性降低。据报道刺激物的进入量和深度是影响皮肤刺激程度的两个主要因素,文章首次在人体上通过SDS给予证实;此外,文章首次发现SDS引起的人体皮肤屏障损伤的第三个因素,我们称之为“刺激传导网络”,即SDS对皮肤的损伤不仅局限于其所到之处,“刺激传导网络”可以将刺激损伤传递到SDS未到达的更深更远处。通过拉曼光谱对皮肤内部进行研究,并结合体外手段例如3D皮肤等,结果一致,进而提出了“现实世界发生的”SDS诱导皮肤损伤的分子学机制。根据该机制设计的表面活性剂拮抗剂简称ASF,数据显示,可以有效阻挡SDS的经皮吸收,进而有效阻止皮肤脂质流失和脂质有序性的降低,对皮肤屏障的保护效果很好,为表面活性剂在人体刺激机制以及保护机制提供进一步佐证。

可诱导共刺激分子参与自发性高血压大鼠肠系膜血管内皮-间质转化及硬化

目的 探究可诱导共刺激分子(ICOS)与自发性高血压大鼠(SHR)肠系膜血管内皮-间质转化(EndMT)及硬化的相关性。方法4周龄SHR大鼠(观察组)及同品系WKY大鼠(对照组)各20只,各组再随机分为4组,5只/组。无创血压测量仪动态监测各组大鼠血压情况,并于4、6、10、30周龄进行实验。采用流式细胞术检测大鼠脾脏CD4+T细胞的ICOS表达频数;RT-PCR法检测大鼠肠系膜中ICOS、VE-cad、α-SMA、Col3 m RNA表达;免疫组化技术检测大鼠肠系膜血管VE-cad、α-SMA、Col3及淋巴组织中ICOS、IL-17A、TGF-β的分布情况;ELISA法检测大鼠血浆中IL-17A、TGF-β含量水平;Masson染色观察大鼠肠系膜血管形态变化;Spearman和Pearson相关分析评价ICOS与VE-cad、α-SMA、Col3及胶原容积分数的相关性。结果 SHR大鼠自6周龄开始,与对照组相比收缩压增高(P<0.05);CD4+T细胞ICOS的表达频数高于同期对照组(P<0.05);肠系膜组织中ICOS、α-SMA、Col3、IL-17A和TGF-β的mRNA及蛋白表达相较于对照组均升高(P<0.05),VE-cad mRNA及蛋白则在10周龄时表达下降(P<0.05);自6周龄始SHR大鼠血浆中IL-17A、TGF-β含量水平提升(P<0.05);肠系膜血管硬化程度不断加剧(P<0.05);肠系膜组织中ICOS mRNA及蛋白表达水平与α-SMA、Col3表达水平和血管硬化程度自6周龄始均呈正相关(P<0.05),与VE-cad表达水平自10周龄始呈负相关(P<0.05)。结论 ICOS可能通过介导相关免疫反应在高血压肠系膜血管EndMT及硬化过程中发挥重要作用。

Th1/Th2平衡、分化簇抗原28、可诱导共刺激分子、程序性死亡受体-1和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4在急性冠脉综合征患者外周血中的表达

目的研究Th1/Th2及相关细胞因子、共信号分子分化簇抗原28(CD28)、可诱导共刺激分子(ICOS)、程序性死亡受体1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)在急性冠脉综合征(ACS)患者外周血中的表达,并探讨其是否参与ACS的发病机制。方法前瞻性选取2021年7月至2022年4月经中山大学附属第三医院粤东医院心血管内科诊断为ACS的120例患者作为研究对象,采用ACS不同亚型的诊断标准将其分为不稳定型心绞痛(UA)组、ST段抬高型心肌梗死(STEMI)组、非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)组,每组各40例。选取同时间段行冠状动脉造影检查正常的40例住院患者作为对照组。采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清中的干扰素(IFN)-γ、白介素(IL)-2、IL-4和IL-10表达水平,采用流式细胞仪检测外周血互助性T细胞(Th)1、Th2细胞占CD4^(+)T细胞的比例以及共信号分子CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4在CD4^(+)T细胞表面的表达水平,通过冠脉造影手术采用SYNTAX评分法评估ACS患者冠脉病变严重程度,比较四组上述各指标之间的差异并进行各指标之间的相关性分析。结果ACS患者外周血中Th1/Th2比值、Th1数量及相关细胞因子IFN-γ和IL-2的血清表达量高于对照组,其外周血CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28、ICOS和PD-1表达量也高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);另外,STEMI组和NSTEMI组的这些指标也均高于UA组,差异有统计学意义(P<0.05);SYNTAX评分与外周血Th1数量、Th1/Th2比值、血清IFN-γ及IL-2水平和外周血CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28及ICOS表达量呈明显正相关(P<0.05);外周血CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28及ICOS表达量均与Th1数量、Th1/Th2比值、血清IFN-γ及IL-2表达水平呈明显正相关(P<0.05)。结论ACS患者外周血中的Th1、相关细胞因子IFN-γ和IL-2以及其CD3^(+)CD4^(+)T细胞的CD28、ICOS和PD-1表达较健康体检者均明显上调,其均可能在ACS的发病机制中发挥了重要作用。

阻断诱导型共刺激分子信号通路对小鼠急性移植物抗宿主病的影响

目的：观察以诱导型共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）融合蛋白阻断ICOS-B7H途径对小鼠急性移植物抗宿主病（acute graft-versus—host disease，aGVHD）的作用。方法：建立以C57BL／6鼠为供体、致死剂量照射的BALB／c鼠为受体的aGVHD模型，分别在移植0、2、4、8d后腹腔注射100Ixg的ICOS-Ig，以注射同剂量的人Ig（h—Is）作为对照。观察小鼠体重、生存率及临床GVHD症状的改变；移植4d后取小鼠脾脏单个核细胞，流式细胞术检测H一2Kd—CD4＋及H-2Kd—CD8＋细胞的CFSE强度，确定供体T淋巴细胞的增殖率；移植10d后采用Annexin—V及PI试剂盒检测供体H-2Kd—CD4及H-2Kd—CD8＋细胞的凋亡率。结果：ICOS-Ig干预可有效减轻小鼠aGVHD的严重程度，ICOS—Ig组小鼠的生存时间比h-Ig组显著延长[（20．0±3．1）vs（10．0±2．1）d，P=0．0217，n=14]，其肠道黏膜病变及肝脏汇管区淋巴细胞浸润明显减少。移植3d后，ICOS-Ig组和h·Ig组小鼠的CD4＋CFSE-和CD8＋CFSE-细胞群比例无明显差异[（98．88±0．76）％铘（99．71±0．27）％，（98．62±0．63）％椰（99．53±0．51）％，P〉0．05]；ICOS—Ig增加了体内异基因CD8＋T淋巴细胞的凋亡率[（15．7±9．59）％掷（25．92±5．66）％，P=0．032]，不影响异基因CD4＋T细胞的凋亡率[（15．72±7．34）％vs（22．78±6．94）％，P=0．078]。结论：阻断ICOS—B7H通路可促进活化的T淋巴细胞凋亡，减轻造血干细胞移植治疗血液肿瘤中发生的aGVHD的严重程度。

共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建共刺激阻断剂CTLA4Ig基因重组的腺病毒载体。 方法 将CTLA4IgcDNA插入腺病毒表达质粒 ;将重组质粒与腺病毒基因组质粒共转染 2 93细胞 ,产生重组腺病毒 ;采用dot ELISA和PCR法筛选并获得CTLA4Ig阳性表达的重组腺病毒。结果 同源重组后 ,以dot ELISA法筛选到 2个 2 93细胞的CTLA4Ig蛋白阳性表达空斑 ,PCR证实为含CTLA4Ig基因和腺病毒基因的重组体AdvCTLA4Ig。结论 本研究构建了CTLA4Ig基因重组的复制缺陷型腺病毒AdvCTLA4Ig 。

可诱导共刺激分子信号介导的免疫应答对血吸虫性肝纤维化形成的影响

目的探讨可诱导共刺激分子（inducibleCO—stimulator，ICOS）信号介导的Th2极化对日本血吸虫所致肝纤维化的影响。方法建立ICOS转基因（ICOS—Tg）小鼠及野生型FVB／NJ小鼠日本血吸虫病模型，分别于感染前（0周）和感染后4、7、12、16和20周采集小鼠血清、脾淋巴细胞和肝脏。脾淋巴细胞用可溶性虫卵抗原（SEA）诱导培养72h后，应用ELISA法分别检测细胞培养上清中细胞因子1干扰素（IFN一1）、白细胞介素12（IL一12）、IL一4和IL．13水平．血清中SEA特异性抗体IgG及其亚类IgGl和IgG2a的水平．以及血清中透明质酸（HA）和羟脯氨酸（HYP）的含量。应用免疫组化法检测各期感染小鼠肝脏中α-平滑肌肌动蛋白（d．SMA）、转移生长因子B1（TGF—B1）和I型胶原蛋白（collagen—I）水平。分别应用苏木素．伊红（HE）染色法和胶原纤维Masson染色法动态观察感染小鼠肝脏虫卵肉芽肿病变及纤维化程度。结果ICOS．Tg小鼠Th2细胞因子IL一4和IL一13水平自感染后7～20周均显著高于野生型小鼠（P〈0．05），Thl细胞因子IFN-γ和IL-12两组之间差异均无统计学意义（P〉0．05）。ICOS—Tg小鼠的1’h2分化指数亦高于野生型小鼠．在感染后7～20周差异均有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。ICOS—Tg小鼠的SEA特异性抗体IgG、IgGl和IgG2a水平均显著高于野生型小鼠（P〈0．05或P〈0．01，感染后4～7周IgG水平除外），IgGl／IgG2a比值均高于野生型小鼠，其中感染后12和16周（ICOS．Tg小鼠为5．75±0．94和4．96±0．98，野生型小鼠为4．31±0．81和3．41±0．83）差异有统计学意义（P〈0．05）。ICOS—Tg小鼠血清中HA和HYP的水平均高于野生型小鼠，分别在感染后7～20周及12～20周两组差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。免疫组化结果显示，ICOS．Wg小鼠于感染后7～20周肝脏仪一SMA和TGF—B1蛋白表达水平均显著高于野生型小鼠（P〈0．05或P〈0．01）；collagen-I的表达水平亦高于野生型小鼠，但仅在感染后20周两组差异有统计学意义（P〈0．05）。肝组织HE染色结果显示，ICOS-Tg小鼠于感染后7、12和16周的单卵肉芽肿体积『分别为（28．72±6．68）×106、（20．47±5．09）×106和（12．77±4．86）×106μm3]，均显著大于同期野生型小鼠『分别为（18．04±6．21）x106、（15．28±4．87）×106和（11．24±4．38）×10^6μm3]（P〈0．05）。Masson染色结果显示．ICOS—Tg小鼠的肝脏纤维化程度较高．但两组的纤维化程度评分差异无统计学意义（P〉0．05）。结论感染日本血吸虫ICOS．Tg小鼠的Th2免疫应答显著上调．且其肝纤维化程度和相关指标均增强．表明ICOS信号介导的Th2极化与感染日本血吸虫导致的肝纤维化有关。

携带可诱导共刺激分子基因的重组腺病毒载体构建及其在小鼠间充质干细胞中的表达

目的阻断可诱导共刺激途径协同骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可能能增强急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)的防治作用。文中旨在构建携带小鼠可诱导共刺激分子(inducible costimula-tor,ICOS)基因的重组腺病毒载体,转染小鼠骨髓MSCs,为转基因治疗提供实验基础。方法设计含有EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点的引物,PCR扩增ICOS,将扩增产物克隆到穿梭质粒PDC318上,筛选阳性克隆,测序鉴定正确,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3-F11B-EGFP在293细胞中同源重组,筛选获得含有ICOS基因的重组腺病毒质粒,行PCR鉴定。重组腺病毒质粒转染293细胞,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度,并转染小鼠MSCs。结果重组腺病毒质粒经鉴定,证实含有ICOS基因,病毒滴度为6.54×109pfu/ml。转染小鼠MSCs,荧光显微镜下可见较多绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测ICOS表达率为90.16%。结论成功构建了携带小鼠ICOS基因的重组腺病毒载体,并获得高滴度的病毒,能高效转染小鼠MSCs,为后续研究奠定了基础。

共刺激阻断剂与雷帕霉素联合应用对移植肾存活的影响

目的:探讨共刺激阻断剂CTLA4Ig与雷帕霉素(Rapamycin,RPM)联合应用对大鼠移植肾存活的影响。方法:肾移植大鼠分为对照组、CTLA4Ig组、RPM组和CTLA4Ig+RPM组,观察术后血肌酐和移植肾病理改变、移植肾存活时间。结果:与对照组相比,CTLA4Ig组、RPM组、CTLA4Ig+RPM组移植肾存活时间均显著延长(P<0.01),其中,CTLA4Ig+RPM组移植肾存活时间最长(76.5±17.1d),术后15天、30天该组血肌酐浓度最低;术后30天,仍然存活的CTLA4Ig组移植肾显示较多淋巴细胞浸润,CTLA4Ig+RPM组移植肾显示很少淋巴细胞浸润。结论:共刺激阻断剂与雷帕霉素联合应用可有效抑制排斥反应,显著延长大鼠移植肾存活时间。

共刺激阻断剂CTLA-4Ig基因修饰的树突状细胞对移植肾存活的影响

目的探讨共刺激信号阻断剂CTLA-4Ig基因修饰的树突状细胞(dendriticcells,DC)对移植肾存活的影响。方法以BN、Lewis大鼠为肾移植供、受体;用CTLA-4Ig基因重组腺病毒转染供、受体骨髓源性DC使之表达CTLA-4Ig;将供、受体DC于肾移植前24h经股静脉分别注入受体(设为组1、组2),供、受体DC混合后注入受体(组3),未注射DC的受体为对照组;观察各组移植肾存活时间,术后第20天,MTT法检测受体脾细胞对供体及无关抗原刺激的反应。结果与对照组相比,组1移植肾存活时间显著延长[(54.1!11.6)dvs(8.4!0.7)d,P<0.01),组3移植肾存活时间延长更为明显(77.5!15.7)d,P<0.001],组2移植肾存活时间无延长(8.1!0.7)d,P>0.05。术后第20天,组1、组3脾细胞对供体抗原刺激的反应均明显低于正常对照(0.27!0.07)and(0.23!0.06)vs(0.74!0.06),P<0.01,而对无关抗原刺激的反应与正常对照差异无显著性(0.68!0.04)and(0.71!0.05)vs(0.69!0.05),P>0.05。结论CTLA-4Ig基因修饰的供体DC可以明显延长大鼠移植肾存活时间,而受体DC则无此作用,但两种DC联合应用可以使移植肾获得更长的存活时间。

树突状细胞共刺激分子表达与免疫抑制剂的干预

背景:以往关于器官移植免疫抑制和抗排斥反应的研究,多关注T淋巴细胞介导的免疫反应及免疫抑制剂对T淋巴细胞的作用,树突状细胞作用尚不清楚,且对于免疫抑制剂对树突状细胞影响的表现及机制亦不尽相同。目的:比较不同免疫抑制剂对树突状细胞共刺激分子表达及功能的影响,探讨其免疫抑制作用机制。方法:在诱导C57BL/6小鼠骨髓细胞定向分化为树突状细胞时分别加入20μg/L雷帕霉素、0.04 mg/L霉酚酸酯、10μg/L他克莫司和1 mg/L环孢霉素A。结果与结论:流式细胞仪检测结果显示,各组CD40表达为:雷帕霉素<他克莫司<环孢霉素A<霉酚酸酯(P<0.01);CD86表达分别为:雷帕霉素<他克莫司<环孢霉素A=霉酚酸酯(P<0.01);CD80、CD11c及主要组织相容性复合体Ⅱ的表达各组差异无显著性意义(P>0.05)。单向混合淋巴细胞反应结果显示,各组树突状细胞共刺激T细胞增殖能力表现为:雷帕霉素<霉酚酸酯<他克莫司=环孢霉素A(P<0.05)。结果证实,雷帕霉素、他克莫司、环孢霉素A、霉酚酸酯均通过抑制树突状细胞共刺激分子CD40及CD86表达而发挥免疫抑制作用,以雷帕霉素最为显著;虽然以上药物对树突状细胞抗原递呈能力主要组织相容性复合体Ⅱ的表达均无明显抑制性,但均能抑制树突状细胞刺激T细胞增殖的能力,雷帕霉素的抑增殖能力最强。

稳定表达可诱导共刺激分子CHO细胞株的筛选及其生物学活性鉴定

目的:构建携带人可诱导共刺激分子(inducible costimulator molecule,ICOS)基因的重组逆转录病毒载体,筛选稳定表达ICOS蛋白的CHO细胞株,并对其生物学活性进行鉴定。方法:RT-PCR法从人PBMC中获取ICOScDNA,定向克隆到逆转录病毒载体上,制备逆转录病毒重组体pMSCV-ICOS;经病毒包装细胞包装后抗性筛选出产高滴度病毒的细胞株,用高滴度病毒上清感染CHO细胞,抗性筛选出稳定表达细胞株。将CHO-ICOS细胞和PBMC以不同比例(1:1、1:2、1:5、1:10)共培养,加入亚刺激剂量(200ng/ml)的抗人CD3抗体,采用3H-TdR掺入法检测PBMC的增殖,流式细胞仪检测T细胞表面活化分子CD25表达情况,并以CHO-pMSCV细胞和PBMC以1:1比例共培养作为阴性对照以及未处理的PBMC作为空白对照。结果:成功构建逆转录病毒重组体pMSCV-ICOS,筛选出稳定表达ICOS蛋白的CHO细胞株。3H-TdR掺入法和流式细胞仪检测结果表明,与阴性对照及空白对照相比,CHO-ICOS细胞与PBMC共培养能抑制CD3抗体诱导的PBMC增殖及活化(P<0.05或P<0.01),细胞比例为1:1时抑制率最大,分别为(68±5.9)%、(44.08±3.26)%。结论:成功建立具有生物学活性的膜稳定表达人ICOS蛋白的CHO细胞株,为今后研究奠定了基础。

异位性皮炎患者外周血T淋巴细胞CD_(28)和可诱导共刺激分子的表达

目的探讨CD28和可诱导共刺激分子(ICOS)在异位性皮炎(AD)患者外周血T淋巴细胞的表达。方法采用免疫荧光双标记流式细胞术检测25例AD患者外周血T淋巴细胞CD28和ICOS的表达,参照欧洲AD评分标准(SCO-RAD)对病情严重程度进行评分,分析CD28和ICOS的表达水平与病情严重程度的相关性。结果AD患者组外周血T淋巴细胞CD28和ICOS的表达水平高于正常对照组(P<0.01),ICOS的表达水平与SCORAD评分呈正相关(r=0.68,P<0.01)。结论AD患者外周血T淋巴细胞CD28和ICOS表达增高,ICOS的表达水平可作为反映病情严重程度的一个指标。

日本血吸虫感染可诱导共刺激分子配体基因敲除小鼠CD154和CD40动态变化及对Th1/Th2偏移的影响

目的:探讨可诱导共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)-ICOS配体(ICOS ligand,ICOSL)信号通路对感染日本血吸虫小鼠的CD154、CD40表达及Th1/Th2偏移的影响。方法:建立ICOSL基因敲除(ICOSL knockout,ICOSL-KO)小鼠及野生型C57BL/6J小鼠感染日本血吸虫疾病模型,于感染前和感染后4、7、12、16、20周,应用流式细胞术、免疫组织化学法分别检测小鼠脾细胞与肝虫卵肉芽肿周围炎性浸润细胞CD154、CD40的水平;应用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠脾细胞经可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)诱导72 h后培养的上清液中γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)水平及小鼠血清中SEA特异性抗体Ig G、Ig G1、Ig G2a的水平;应用HE染色观察小鼠肝虫卵肉芽肿病变动态变化。结果:感染后4、7、12、16、20周,ICOSL-KO小鼠脾细胞CD154、CD40水平与野生型小鼠相比,显著降低[CD154为(18.62±4.76)%vs.(27.91±3.94)%、(22.44±4.67)%vs.(40.86±5.21)%、(25.50±6.81)%vs.(43.81±8.41)%、(20.22±5.28)%vs.(40.95±7.34)%、(17.87±4.59)%vs.(33.16±6.31)%,皆P<0.01;CD40为(19.43±3.26)%vs.(24.37±3.59)%、(23.00±4.47)%vs.(31.80±5.86)%、(24.46±5.01)%vs.(35.85±5.32)%、(23.42±4.69)%vs.(33.30±6.14)%、(22.85±3.78)%vs.(30.88±5.94)%,皆P<0.05]。感染后7、12、16、20周,ICOSL-KO小鼠肝虫卵肉芽肿炎性浸润细胞CD154、CD40水平与野生型小鼠相比,亦显著降低[CD154为(0.319±0.066)vs.(0.488±0.086)、(0.389±0.067)vs.(0.596±0.082)、(0.378±0.064)vs.(0.543±0.072)、(0.348±0.069)vs.(0.523±0.076),皆P<0.01;CD40为(0.398±0.066)vs.(0.546±0.079)、(0.461±0.085)vs.(0.618±0.076)、(0.453±0.087)vs.(0.587±0.074)、(0.449±0.065)vs.(0.565±0.082),皆P<0.05]。感染后,ICOSL-KO小鼠IFN-γ表达显著高于野生型小鼠(P<0.05),而IL-4表达水平则显著低于野生型小鼠(P<0.05),其Th2分化指数亦显著低于野生型小鼠(P<0.01)。ICOSL-KO小鼠血清SEA特异性抗体Ig G、Ig G1、Ig G2a的水平与Ig G1/Ig G2a的比值亦显著低于野生型小鼠(P<0.01),且ICOSL-KO小鼠的肝虫卵肉芽肿体积显著小于野生型小鼠(P<0.01)。结论:ICOS-ICOSL信号通路在血吸虫病免疫病理中起重要调控作用,其对Th1/Th2偏移的影响可能是通过调控CD154-CD40信号通路来实现的。

可诱导共刺激分子和小鼠免疫球蛋白融合基因的分泌表达及生物学活性

目的：为获得重组可诱导共刺激分子胞外段与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白（ICOS-Ig）并研究其生物学活性，以探讨它作为免疫拮抗剂阻断ICOS／B7RP-1共刺激通路的作用。方法：克隆编码人可诱导共刺激分子（ICOS）胞外片段，与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段（Ig）的基因融合，构建ICOS-Ig融合基因及其分泌型真核表达载体pSecTag2／Hygro A-ICOS-Ig；构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株，用Western blot和ELISA法检测其表达、流式细胞仪（FACS）检测其配体结合活性、混合淋巴细胞反应（MLR）及细胞因子检测测定其生物学活性。结果：核苷酸序列测定显示克隆基因的核苷酸与Genebank序列一致：ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达，其含量可达5～25μg／ml；该重组蛋白有配体结合活性，可体外抑制淋巴细胞增殖、减少IL-2、IFN-γ的分泌。结论：重组ICOS-Ig融合基因及其真核表达载体的构建完成并获得高效表达，该重组蛋白具有配体结合活性，可在体外通过抑制ICOS／B7RP-1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖及细胞因子分泌。

可诱导共刺激分子在BXSB狼疮小鼠肾脏中的表达

目的观察可诱导共刺激分子(ICOS)在BXSB狼疮小鼠肾脏中的表达,探讨ICOS在狼疮肾炎发病机制中的潜在作用。方法选取8周龄及16周龄雄性BXSB小鼠各6只,并以8周龄C57BL/6雄性小鼠6只为正常对照,用免疫组织化学及实时荧光定量PCR方法,检测ICOS在小鼠肾脏中的表达水平。结果正常对照组C57BL/6小鼠肾组织ICOS染色少许肾小管细胞呈浅棕色;8周龄及16周龄BXSB小鼠肾脏组织ICOS强阳性表达,细胞呈深棕色着色,分布于肾小管。8、16周龄BXSB组小鼠肾组织内ICOS mRNA表达水平[(6.43±0.92),(9.48±1.30)]均较正常对照组(4.58±0.63)增加,差异有统计学意义(均P<0.01);16周龄BXSB组小鼠的ICOS mRNA表达水平较8周龄BXSB组增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论肾组织ICOS的分布及表达增加可能是BXSB小鼠狼疮肾炎发病的重要机制之一。

可诱导共刺激分子在川崎病患儿外周血T淋巴细胞的表达

目的探讨可诱导共刺激分子(ICOS)在川崎病(KD)及KD伴有冠状动脉损害,IVIG非敏感型KD发病机制中的作用。方法应用荧光定量PCR检测48例KD组和30例KD IVIG治疗组ICOSmRNA表达的变化。同时以25例同龄健康儿童和20例急性支气管肺炎患儿作为对照。结果 KD组与对照相比,ICOSmRNA表达显著升高(17.97±7.22对8.01±5.15,P<0.01)。其中冠状动脉损害组较无冠状动脉损害组ICOS表达异常升高(29.09±10.55对11.68±5.11,P<0.01)。KD IVIG组与KD组比较,ICOSmRNA表达降低(13.03±5.15对17.97±7.22,P<0.05)。其中IVIG不敏感组与IVIG敏感组比较,ICOS表达显著升高(21.57±6.22对9.85±5.89,P<0.05)。结论 B7/CD28家族分子中正性调节因子ICOS过度表达可能是导致KD免疫失衡的原因之一,正性调节因子过度表达可能与KD冠状动脉损害有关。IVIG治疗在纠正KD淋巴细胞过度活化中发挥作用,同时可能有下调正性调控因子表达的作用。

可诱导T细胞共刺激分子在结肠癌组织中的表达情况及其与远期生存的相关性研究

目的探讨分析可诱导T细胞共刺激分子(inducible T-cell co-stimulator,ICOS)在结肠癌组织中的表达情况及其与远期生存的相关性。方法选取2018年5月至2019年5月期间在大连大学附属新华医院进行手术切除结肠组织的206例结肠癌患者作为研究对象,取其结肠癌组织及癌旁组织标本,使用荧光定量PCR检测结肠癌组织及癌旁组织中可诱导T细胞共刺激分子表达水平,分析其表达与临床病理特征的关系及远期生存的相关性。结果结肠癌组织中ICOS表达水平(8.73±2.25)显著低于癌旁组织的(18.54±3.26),差异有统计学意义(P<0.05);结肠癌组织中ICOS表达水平与肿瘤直径、远处转移、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度差异无统计学意义(P>0.05);ICOS表达在206例结肠癌组织的中低表达117例,高表达89例;ICOS高表达和低表达与临床病理因素进行Logistic二次回归分析结果显示,ICOS表达与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移、远处转移有关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤位置、分化程度无关(P>0.05);随访截止至2021年9月30日,206例结肠癌患者存活率83.01%(171/206),死亡率16.99%(35/206),中位生存时间为(23.5±3.3)个月。ICOS高表达的89例结肠癌患者的中位生存期为(27.4±3.2)个月,95%CI为2.234~6.147;ICOS低表达的117例结肠癌患者的中位生存期为(16.3±4.3)个月,95%CI为1.458~5.237,ICOS高表达结肠癌患者中位生存期显著高于ICOS低表达者(P<0.05)。结论ICOS在结肠癌组织中呈较低表达,其表达水平与患者远期生存呈正相关关系,其水平可作为结肠癌患者预后生存的重要评估指标。

诱导共刺激分子研究新进展

诱导共刺激分子(ICOS)是新近发现的免疫诱导共刺激分子,是一类参与免疫应答的重要分子。就ICOS的结构、ICOS的表达、ICOS的功能和作用及其与临床疾病联系等方面的研究作一综述。ICOS的发现和认识将为深入研究过敏症、慢性移植排斥反应、肿瘤免疫、感染和一些自身免疫性疾病的发病机理提供帮助,可为这些疾病的治疗提供新的思路和方法。

人可诱导共刺激分子胞外片段和小鼠免疫球蛋白Ig融合基因的表达及生物学活性鉴定

目的:探讨用基因工程方法表达的人可诱导共刺激分子(ICOS)与小鼠免疫球蛋白的融合蛋白竞争抑制ICOS B7RP1共刺激通路的作用。方法:以RT PCR方法克隆编码人ICOS胞外片段,与编码小鼠免疫球蛋白IgG恒定片段(Ig)的基因融合,构建携带融合基因的高效真核表达载体pcDNA4/HisMAX A ICOS Ig。采用脂质体法转染CHO细胞,用Western印迹法检测稳定表达细胞中融合基因的表达,流式细胞术检测重组蛋白的配体结合活性。以适当浓度的重组融合蛋白作为拮抗剂与BALB/c和C57BL小鼠脾单个核细胞进行混合培养,观察重组蛋白在体外抑制淋巴细胞增殖的效果。结果:构建了携带融合基因的高效真核表达载体pcDNA4/HisMAX A ICOS Ig; Western印迹法检测表明转染细胞有重组蛋白的表达;流式细胞术分析显示重组蛋白有配体表达细胞的结合活性;该重组融合蛋白作为拮抗剂可体外抑制混合淋巴细胞增殖。结论:构建并成功表达了ICOS Ig融合基因高效真核表达载体;该重组蛋白具有配体结合活性,可在体外通过抑制ICOS B7RP 1共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。

可诱导共刺激分子诱导骨髓来源不成熟树突状细胞特异性分泌IL-6

目的:分析可诱导共刺激分子(ICOS)可溶性融合蛋白(ICOSIg)能否向不成熟DCs传递逆向信号及其性质。方法:以流式细胞仪结合特异性抗体检测DCs表型分子改变;以ELISA检测培养上清细胞因子变化;以RT-PCR检测各组DCs细胞内细胞因子及受体、趋化因子等mRNA表达水平。结果:ICOSIg或膜锚定ICOS作用于不成熟DCs,均可诱导其高表达MHC-Ⅱ、CD80、CD86和CD83等表型分子;促进DCs特异性分泌IL-6。结论:ICOS作用于不成熟DCs表面的ICOSL可以向DCs细胞传递逆向信号,诱导DCs细胞高分泌IL-6,同时其表面重要的表型分子也上调,可能参与了DCs细胞免疫功能的调节,其信号转导机制可能涉及p38-MAPK通路。