慢性HBV感染者外周血可诱导共刺激分子在CD8+ T淋巴细胞的表达及其临床意义

目的 探讨慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者外周血可诱导共刺激分子(ICOS)在CD8+T淋巴细胞的表达特点及临床意义。方法 选取2017年5月—2018年10月就诊的慢性乙型肝炎(CHB)100例、HBV-肝硬化(LC)25例和HBV-慢加急(或亚急)性肝衰竭(ACLF)26例分别纳入CHB组、HBV-LC组和HBV-ACLF组,健康对照(NC)组35例来自同期门诊体检健康者。采用流式细胞仪检测各组ICOS在CD8+T淋巴细胞的表达情况;分析CD8+T淋巴细胞ICOS表达水平与慢性HBV感染者疾病严重程度、HBV-ACLF预后及并发症的相关性;动态观察HBV-ACLF患者治疗过程中CD8+T淋巴细胞ICOS表达变化。结果 HBV-ACLF组外周血CD8+T淋巴细胞ICOS表达比率及平均荧光强度(MFI)均高于CHB组、HBV-LC组和NC组(P<0.05)。慢性HBV感染者ICOS的MFI与白蛋白、胆碱酯酶、总胆固醇、血红蛋白呈负相关(r=-0.263、-0.269、-0.273、-0.302,P=0.003、0.003、0.011、0.004);与直接胆红素、天冬氨酸转氨酶、凝血酶原时间、国际标准化比值呈正相关(r=0.248、0.208、0.331、0.315,P=0.005、0.020、0.003、0.009);与HBV-DNA、腹水及感染无明显相关性(P>0.05)。治疗过程中,HBV-ACLF患者ICOS的MFI无明显改变。但生存组ICOS的MFI在治疗第1周时较治疗前上升(P<0.05)。结论 HBV-ACLF患者外周血CD8+T淋巴细胞ICOS的表达水平明显升高,并与肝脏合成功能、炎症程度及预后相关,治疗早期ICOS水平变化有助于预测慢性HBV感染者的预后。

T细胞可诱导共刺激分子配体胞外段基因的克隆与表达

目的:克隆T细胞可诱导共刺激分子配体胞外段(ICOSL-N)基因,构建pET22b-ICOSL-N-Ig原核表达载体,实现ICOSL-N与IgG4体外融合表达。方法:设计并合成T细胞ICOSL-N和IgG4基因特异性引物,RT-PCR法从小鼠脾脏中克隆出ICOSL-N,PCR重叠延伸技术将ICOSL-N与IgG4基因融合,构建原核表达载体pET22b-ICOSL-N-Ig,转化E.coli BL21(DE3)工程菌,筛选鉴定阳性克隆,IPTG诱导阳性重组子,SDS-PAGE法鉴定融合蛋白ICOSL-N-Ig的表达。结果:融合基因ICOSL-N-Ig的PCR扩增产物大小约1425 bp,符合理论值;原核表达载体pET22b-ICOSL-N-Ig经酶切、PCR和测序鉴定结果符合预期;在诱导后的菌体中检测出大小为53800的蛋白诱导条带,且与目标蛋白的大小一致。结论:成功克隆ICOSL-N基因,实现ICOSL-N在E.coli BL21(DE3)工程菌中与IgG4的融合表达。

日本血吸虫感染可诱导共刺激分子配体基因敲除小鼠CD154和CD40动态变化及对Th1/Th2偏移的影响

目的:探讨可诱导共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)-ICOS配体(ICOS ligand,ICOSL)信号通路对感染日本血吸虫小鼠的CD154、CD40表达及Th1/Th2偏移的影响。方法:建立ICOSL基因敲除(ICOSL knockout,ICOSL-KO)小鼠及野生型C57BL/6J小鼠感染日本血吸虫疾病模型,于感染前和感染后4、7、12、16、20周,应用流式细胞术、免疫组织化学法分别检测小鼠脾细胞与肝虫卵肉芽肿周围炎性浸润细胞CD154、CD40的水平;应用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠脾细胞经可溶性虫卵抗原(soluble egg antigen,SEA)诱导72 h后培养的上清液中γ-干扰素(interferon gamma,IFN-γ)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)水平及小鼠血清中SEA特异性抗体Ig G、Ig G1、Ig G2a的水平;应用HE染色观察小鼠肝虫卵肉芽肿病变动态变化。结果:感染后4、7、12、16、20周,ICOSL-KO小鼠脾细胞CD154、CD40水平与野生型小鼠相比,显著降低[CD154为(18.62±4.76)%vs.(27.91±3.94)%、(22.44±4.67)%vs.(40.86±5.21)%、(25.50±6.81)%vs.(43.81±8.41)%、(20.22±5.28)%vs.(40.95±7.34)%、(17.87±4.59)%vs.(33.16±6.31)%,皆P<0.01;CD40为(19.43±3.26)%vs.(24.37±3.59)%、(23.00±4.47)%vs.(31.80±5.86)%、(24.46±5.01)%vs.(35.85±5.32)%、(23.42±4.69)%vs.(33.30±6.14)%、(22.85±3.78)%vs.(30.88±5.94)%,皆P<0.05]。感染后7、12、16、20周,ICOSL-KO小鼠肝虫卵肉芽肿炎性浸润细胞CD154、CD40水平与野生型小鼠相比,亦显著降低[CD154为(0.319±0.066)vs.(0.488±0.086)、(0.389±0.067)vs.(0.596±0.082)、(0.378±0.064)vs.(0.543±0.072)、(0.348±0.069)vs.(0.523±0.076),皆P<0.01;CD40为(0.398±0.066)vs.(0.546±0.079)、(0.461±0.085)vs.(0.618±0.076)、(0.453±0.087)vs.(0.587±0.074)、(0.449±0.065)vs.(0.565±0.082),皆P<0.05]。感染后,ICOSL-KO小鼠IFN-γ表达显著高于野生型小鼠(P<0.05),而IL-4表达水平则显著低于野生型小鼠(P<0.05),其Th2分化指数亦显著低于野生型小鼠(P<0.01)。ICOSL-KO小鼠血清SEA特异性抗体Ig G、Ig G1、Ig G2a的水平与Ig G1/Ig G2a的比值亦显著低于野生型小鼠(P<0.01),且ICOSL-KO小鼠的肝虫卵肉芽肿体积显著小于野生型小鼠(P<0.01)。结论:ICOS-ICOSL信号通路在血吸虫病免疫病理中起重要调控作用,其对Th1/Th2偏移的影响可能是通过调控CD154-CD40信号通路来实现的。

可诱导T细胞共刺激分子在结肠癌组织中的表达情况及其与远期生存的相关性研究

目的探讨分析可诱导T细胞共刺激分子(inducible T-cell co-stimulator,ICOS)在结肠癌组织中的表达情况及其与远期生存的相关性。方法选取2018年5月至2019年5月期间在大连大学附属新华医院进行手术切除结肠组织的206例结肠癌患者作为研究对象,取其结肠癌组织及癌旁组织标本,使用荧光定量PCR检测结肠癌组织及癌旁组织中可诱导T细胞共刺激分子表达水平,分析其表达与临床病理特征的关系及远期生存的相关性。结果结肠癌组织中ICOS表达水平(8.73±2.25)显著低于癌旁组织的(18.54±3.26),差异有统计学意义(P<0.05);结肠癌组织中ICOS表达水平与肿瘤直径、远处转移、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度差异无统计学意义(P>0.05);ICOS表达在206例结肠癌组织的中低表达117例,高表达89例;ICOS高表达和低表达与临床病理因素进行Logistic二次回归分析结果显示,ICOS表达与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移、远处转移有关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤位置、分化程度无关(P>0.05);随访截止至2021年9月30日,206例结肠癌患者存活率83.01%(171/206),死亡率16.99%(35/206),中位生存时间为(23.5±3.3)个月。ICOS高表达的89例结肠癌患者的中位生存期为(27.4±3.2)个月,95%CI为2.234~6.147;ICOS低表达的117例结肠癌患者的中位生存期为(16.3±4.3)个月,95%CI为1.458~5.237,ICOS高表达结肠癌患者中位生存期显著高于ICOS低表达者(P<0.05)。结论ICOS在结肠癌组织中呈较低表达,其表达水平与患者远期生存呈正相关关系,其水平可作为结肠癌患者预后生存的重要评估指标。

氧化型低密度脂蛋白对可诱导共刺激分子在人外周血T细胞表达的影响

目的:探讨可诱导共刺激分子(ICOS)在人外周血T细胞的表达及氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的干预作用。方法:以人外周血T细胞为实验模型,通过间接免疫荧光法、RT-PCR和Western blot等方法,观察ox-LDL对人外周血T细胞表达ICOS的影响。结果:①ICOS表达于人外周血T细胞膜,荧光信号呈点状散在分布于细胞表面。RT-PCR检测显示,ICOS mRNA的扩增片段位于相当于Marker 368 bp的位置。Western blot检测显示,ICOS的分子量约为55 kD。②ox-LDL刺激组ICOS的吸光度(A)值高于空白对照组,提示ox-LDL能够明显增加人外周血T细胞中的ICOS mRNA和其蛋白的表达(P<0.05)。结论:ICOS表达于人外周血T细胞表面,ox-LDL能够上调ICOSmRNA和其蛋白的表达,这可能是动脉粥样硬化的免疫学发病机制之一。

诱导共刺激分子对Th17细胞发展的作用

Th17细胞是近年来被鉴定出的一类新型CD4阳性效应T细胞亚群,与传统的Th1、Th2细胞不同,该细胞具有独立的分化和发育调节机制。诱导共刺激分子(ICOS)是CD28家族的第3个成员,它在效应性T细胞上的表达具有正性共刺激作用。ICOS和Th17细胞都参与了肿瘤免疫,深入理解和认识ICOS对Th17细胞发展的作用,有助于设计新的有效的肿瘤治疗方案。

可诱导共刺激分子介导的Th17细胞极化对自发性高血压大鼠肾纤维化的影响

目的探讨可诱导共刺激分子(ICOS)介导的Th17细胞极化在原发性高血压肾损害中的作用。方法 4周龄的自发性高血压大鼠(SHR)随机分为SHR-C组及SHR-I组,分别用0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液(PBS)、ICOS阻断型单克隆抗体干预2周。采用无创尾动脉血压测量仪动态监测大鼠的血压。采用流式细胞技术分析大鼠脾淋巴细胞中Th17细胞的频数变化。RT-PCR法动态检测大鼠肾脏中IL-17A m RNA的表达水平。采用免疫组化技术及ELISA法动态检测大鼠肾脏及血浆中IL-17A和TGF-β1的表达水平。采用Masson染色检测大鼠肾脏病理改变情况。结果 SHR-C组大鼠从第10周始血压显著高于同期的SHR-I组大鼠(P<0.05或P<0.01)。从6周始SHR-C组的大鼠Th17细胞频数显著高于同期SHR-I组(P<0.05)。SHR-C组的大鼠肾脏中IL-17A m RNA表达亦显著高于同期SHR-I组(P<0.05),且其血浆和肾脏中IL-17A、TGF-β1的表达显著高于同期SHR-I组(P<0.05)。与SHR-C组相比,SHR-I组的大鼠肾脏纤维化程度降低,在30周两者差异具有显著性(P<0.05)。结论由ICOS介导的Th17细胞极化在高血压导致的肾纤维化中起重要作用。

复发性生殖器疱疹患者外周血T淋巴细胞和共刺激分子的检测

目的检测复发性生殖器疱疹(RGH)患者外周血中T细胞亚群和共刺激分子的表达,探讨其在RGH免疫中的作用。方法用免疫荧光技术和流式细胞仪检测RGH及对照组血中T细胞亚群和共刺激分子(CD28,CD25,Fas,FasL,4-1BB)的水平。结果 RGH组CD3+,CD4+/CD8+,CD4+CD28+细胞百分数(59.48±10.9,0.89±0.20,27.69±7.34)显著低于健康对照组(69.79+5.63,1.14+0.39,33.68±7.32),差异均有统计学意义(P<0.05);CD4+CD28-,CD25+细胞百分数及Fas(6.55±4.46,15.81±8.62,27.58±3.10)显著高于健康对照(1.93±1.36,7.13±5.13,23.11±5.63),差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论 RGH外周血CD3+,CD4+/CD8+下降,CD4+CD28+低表达,及CD25+和Fas高表达,可能是RGH复发的免疫障碍环节之一。

不同免疫状态肝移植受者外周血T淋巴细胞亚群及共刺激分子的表达及意义

目的探讨不同免疫状态肝移植受者外周血T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+)、共刺激分子(CD80、CD86)的表达,及其判断肝移植受者不同免疫状态的价值。方法 52例肝移植受者,分为免疫耐受组28例、急性排斥反应组(排斥组)13例、药物不良反应组(药物反应组)11例。采用流式细胞术测定三组患者外周血CD4+、CD8+及CD80、CD86的表达水平,并计算CD4+/CD8+。结果与免疫耐受组和药物反应组比较,排斥组患者外周血CD8+水平较低,而CD4+、CD4+/CD8+、CD80、CD86均较高(P<0.05～0.01)。与免疫耐受组比较,药物反应组患者外周血CD8+、CD80、CD86水平明显升高(P<0.05～0.01),而CD4+、CD4+/CD8+差异无统计学意义(均为P>0.05)。结论免疫T淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+及CD4+/CD8+)、CD80、CD86可作为判断肝移植受者免疫状态的指标。

大剂量过敏原对致敏小鼠DC表面共刺激分子表达及调节性T细胞极化的作用

目的观察和比较致敏小鼠及正常小鼠DC表面共刺激分子表达及CD4+CD25+Foxp3+T数量的差异及大剂量过敏原在体外的作用。方法流式细胞仪检测致敏及正常对照小鼠脾脏DC表面分子CD11c、MHCⅡ、CD80、CD86表达。分离致敏及正常对照小鼠CD4+T细胞,流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量。致敏小鼠脾脏DC、CD4+T细胞与10 mg/ml OVA或生理盐水共培养后,流式细胞仪检测并比较CD80、CD86等共刺激分子的表达及CD4+CD25+Foxp3+T细胞的数量。结果致敏小鼠脾脏DC表面共刺激分子CD80、CD86、MHCⅡ表达显著高于正常对照小鼠。10 mg/ml的OVA作用后,致敏小鼠脾脏DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达明显降低。致敏小鼠脾脏细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量显著低于正常对照小鼠。10 mg/ml的OVA作用后,致敏小鼠CD4+CD25+Foxp3+T细胞数量显著上升。结论大剂量过敏原在体外诱导致敏小鼠T细胞的不反应性,其机制与降低致敏小鼠DC共刺激分子表达,诱导调节性T细胞极化等有关。

阿糖胞苷增强K562细胞共刺激分子B7表达以及对T细胞的免疫应答

目的探讨阿糖胞苷(Ara-c)对白血病细胞(K562)B7分子表达以及对T细胞免疫应答的影响。方法用流式细胞术检测K562细胞经Ara-c处理后B7分子的表达以及对T细胞表面标记的影响。MTT法检测不同效靶比的情况下,诱导后的K562细胞对外周血单个核细胞(PBMNC)的刺激作用,以及用RT-PCR法检测B7分子刺激PBMNC分泌细胞因子γ干扰素(IFN-γ)的测定。结果Ara-c能刺激K562细胞B7分子的表达,呈时间依赖性。诱导后的K562细胞显著刺激PBMNC增殖并产生IFN-γ,并能检测到T细胞表面标记。结论Ara-c通过刺激K562细胞B7分子表达,显著提高了白血病细胞的免疫原性。

桥本甲状腺炎患者γδ T细胞表面共刺激分子的表达及意义

目的探讨桥本甲状腺炎(HT)患者γδT细胞与自身抗体形成之间的关系及机制,寻找潜在的干预靶点。方法流式细胞术检测19例HT患者、15例健康对照者外周血及5例HT和5例单纯性甲状腺肿患者甲状腺组织中γδT细胞及其亚型的比例水平;流式细胞术检测γδT细胞表面活化分子CD69、HLA-DR以及共刺激分子CD40配体(CD40L)、诱导性共刺激分子(ICOS)的表达水平;ELISA检测γδT细胞和B细胞共培养上清中Ig G、Ig M水平,并通过抗体阻断实验分析参与B细胞抗体产生的分子机制。结果与健康对照组相比,HT患者Vδ1+γδT细胞比例明显增加;CD69、HLA-DR、CD40L、ICOS的表达水平均显著上调;γδT细胞和B细胞共培养上清中Ig G的水平显著增高,而添加抗CD40L和抗ICOS抗体能够使共培养上清中Ig G的表达水平明显下降。结论 HT患者的γδT细胞通过表达共刺激分子CD40L和ICOS为B细胞提供协同刺激信号辅助其产生抗体,提示γδT细胞在HT的发病机制中可能发挥着重要作用。

骨髓增生异常综合征CD3^+CD4^+T细胞共刺激分子表达的研究

本研究检测骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS?CD3+CD4+T细胞共刺激分子的表达,为进一步探讨MDS发病机制积累信息。以38例初治MDS患者为研究对象,依据FAB分型将他们进一步划分为RA/RARS、RAEB/RAEB-t组;以11例献血员为正常对照,应用流式细胞术检测两组外周血CD3+CD4+T细胞共刺激分子CD28、CD154、CTLA-4、PD-1、CD25的表达。结果表明:MDS组CD28表达下降,CD154升高,CTLA-4、PD-1、CD25表达明显升高。随着疾病恶性程度的增高,RAEB/RAEB-t组CTLA-4、PD-1的表达以及CTLA-4/CD28比值亦较RA/RARS组升高。结论:MDS患者CD3+CD4+T细胞共刺激分子表达存在异常改变,其表达异常可能在MDS的发病机制中起一定作用。

携带可诱导共刺激分子基因的重组腺病毒载体构建及其在小鼠间充质干细胞中的表达

目的阻断可诱导共刺激途径协同骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可能能增强急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)的防治作用。文中旨在构建携带小鼠可诱导共刺激分子(inducible costimula-tor,ICOS)基因的重组腺病毒载体,转染小鼠骨髓MSCs,为转基因治疗提供实验基础。方法设计含有EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点的引物,PCR扩增ICOS,将扩增产物克隆到穿梭质粒PDC318上,筛选阳性克隆,测序鉴定正确,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒pPE3-F11B-EGFP在293细胞中同源重组,筛选获得含有ICOS基因的重组腺病毒质粒,行PCR鉴定。重组腺病毒质粒转染293细胞,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度,并转染小鼠MSCs。结果重组腺病毒质粒经鉴定,证实含有ICOS基因,病毒滴度为6.54×109pfu/ml。转染小鼠MSCs,荧光显微镜下可见较多绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测ICOS表达率为90.16%。结论成功构建了携带小鼠ICOS基因的重组腺病毒载体,并获得高滴度的病毒,能高效转染小鼠MSCs,为后续研究奠定了基础。

一种新的共刺激信号CD_(137)在人T细胞及其亚群中的表达特点

目的：为了分析ＣＤ１３７ 在正常人静止状态和受ＰＨＡ刺激后不同时间Ｔ淋巴细胞及其亚群上的表达特点和规律。方法：采用免疫细胞化学和流式细胞术。结果：发现未刺激的淋巴细胞上无ＣＤ１３７ 表达。经ＰＨＡ 刺激后（ 仅Ｔ细胞发生转化） ，２４ ｈ 已有表达，以后表达率逐渐增高。免疫细胞化学法显示，２４、４８ 、７２ ｈ ＣＤ１３７ 的表达率分别为（１００ ±２０） ％ 、（１３０ ±２０） ％ 、（２００±４０） ％ ，ＣＤ１３７ 表达在细胞膜表面，细胞浆、细胞核无表达。流式细胞仪测定结果与免疫细胞化学法相吻合，ＰＨＡ 刺激２４、４８ 、７２ ｈ 的表达率分别为（８１６ ±１２８） ％ 、（１２３９ ±２１５） ％ 、（２１６０ ±４３０） ％ 。ＣＤ４＋ Ｔ细胞和ＣＤ８＋ 细胞均可表达，但在ＣＤ４＋ Ｔ细胞上的表达率高于ＣＤ８＋ 细胞。结论：ＣＤ１３７ 仅表达于活化Ｔ细胞表面，ＣＤ４＋ 和ＣＤ８＋ 细胞均可表达。静止Ｔ细胞无ＣＤ１３７ 表达。

FK506对肝移植受者外周血T细胞亚群及共刺激分子表达调节的研究

目的通过观察他克莫司(FK506)对肝移植患者T细胞亚群及T细胞表面CD28、CD152和可诱导共刺激分子(ICOS)表达的影响,探讨FK506对细胞信号传导通路的作用。方法流式细胞技术测定健康对照组、终末期肝脏疾病患者组及使用FK506治疗的肝移植患者组T细胞亚群及各亚群细胞表面CD28、CD152和ICOS的表达。结果CD3+T细胞总数在3组间差异无显著性;与疾病对照组比较,治疗组CD4+T细胞数明显下降,CD8+T细胞数明显增加;CD4+T细胞和CD8+T细胞上CD28和ICOS的表达均显著降低,而CD152分子则均显著升高。结论FK506对治疗组患者T细胞亚群平衡紊乱的迅速纠正有重要作用。通过抑制正性共刺激分子并同时促进负性共刺激分子表达,FK506可在T细胞免疫信号传导通路的上游阻断T细胞活化信号的传导,发挥了免疫调节功能。

共刺激对T细胞功能和细胞因子格局的作用

利用Ｂ７－１单抗和环孢素Ａ（ＣｓＡ）处理ＡＰＣｖＴ细胞反应系统，探讨了Ｂ７／ＣＤ２８共刺激对Ｔ细胞增殖及细胞因子产生的影响，并用ＲＴ－ＰＣＲ方法分析了细胞因子基因格局的改变。结果表明Ｂ７－１单抗可抑制特异性抗原诱导的Ｔ细胞增殖和ＩＬ－２的产生，Ｂ７－１单抗与ＣｓＡ联用可阻断Ｔ细胞增殖和ＩＬ－２产生。Ｂ７－１单抗对ＩＬ－４的产生未显示明显的影响（Ｐ＞ ０．０５），而Ｂ７－１单抗与ＣｓＡ联用ＩＬ－４仍可检测到（Ｐ＞ ０．０５）。Ｂ７－１单抗能抑制ＩＬ－２和γ－ＩＦＮｍ ＲＮＡ表达，Ｂ７－１单抗与ＣｓＡ联用能够阻断ＩＬ－２和γ－ＩＦＮ ｍ ＲＮＡ表达，ＩＬ－４和ＩＬ－１０ｍ ＲＮＡ仍能表达。

γδT细胞表达共刺激分子及协同信号通路的研究进展

根据T细胞受体的不同,人体T淋巴细胞分为αβT细胞和γδT细胞。近年αβT细胞共刺激信号在调节T细胞活化及耐受方面的研究取得了重要的进展,而在γδT细胞相关的研究较少。明确这些共刺激分子及其信号通路在γδT细胞免疫应答的不同阶段发挥的不同正向负向调节作用,将为病毒感染、肿瘤、自身免疫性疾病、移植后排斥等疾病的治疗提供新的前景。