右旋糖酐蔗糖酶工程菌株的构建及其培养条件的研究

【目的】右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为底物,催化转移D-葡萄糖基生成α-葡聚糖或低聚糖的葡萄糖基转移酶。【方法】利用PCR扩增技术,将已获得的右旋糖酐蔗糖酶基因dexYG亚克隆到表达载体PET28a(+)上,转化E.coli BL21(DE3),经过卡那霉素抗性筛选和酶切验证后,得到右旋糖酐蔗糖酶工程菌株BL21(DE3)/pET28-dexYG。【结果】经IPTG诱导该基因在E.coli BL21(DE3)中能有效表达,在诱导过程中菌体生长受到抑制。通过对培养时间、IPTG浓度、培养温度、菌浓(OD600)和pH值等产酶因素的优化考察,得到最佳培养条件为:培养时间5h、IPTG浓度0.5mmol/L、25℃、OD600值1.0和pH6.0。酶活力由最初的5.39U/mL提高到35.62U/mL,其中pH值对产酶活力影响最大,在pH6.0时的最高产酶活力是LB原始pH条件下最高酶活的3.5倍,并且pH值也是导致在诱导后期酶活迅速下降的主要原因之一。【结论】酶的表达和酶活的研究结果表明,构建的工程菌株能够异源高效表达右旋糖酐蔗糖酶,并且表现出较高的酶活力。

重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶的纯化及其性质

【目的】研究工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-dexYG产右旋糖酐蔗糖酶的纯化和酶学性质。【方法】工程菌经过IPTG诱导后生产含His-tag融合蛋白的右旋糖酐蔗糖酶,通过硫酸铵沉淀、Ni-NTA亲和层析纯化,得到纯度较高的酶蛋白,并对纯酶进行了酶学性质及动力学研究。【结果】经过SDS-PAGE测得该酶的分子量约为170kDa,与理论推测值基本相同。以蔗糖为底物,酶促反应的最适温度为25～30℃,最适pH值为5.4,动力学常数Km值为10.43mmol/L;酶活在pH5.0～8.0较为稳定,在室温(25℃)保藏4天仍有59%的酶活力,4℃保存7周酶活力仅下降一半,但在35℃以上失活很快;Ca2+对催化作用有较大的促进,Mg2+有微弱的促进作用,K+对催化反应无影响,Cu2+的抑制作用最强。其他试剂对重组酶的活性有不同程度的影响,其中SDS抑制作用很强。【结论】研究为重组右旋糖酐蔗糖酶纯酶的获取、得到稳定性好、活性高的酶反应体系及利用该酶进行催化反应和工业化应用提供了重要参数。

海藻酸钠-琼脂混合固定化重组右旋糖酐蔗糖酶的研究

以海藻酸钠和琼脂混合物作为载体对右旋糖酐蔗糖酶固定化条件及其特性进行研究,结果表明:4%海藻酸钠和1%琼脂按1:1(V/V)混合后作为载体制备的微球固定化酶表现出持续高活力,在第6批次转化率仍在40%左右;海藻酸钠-琼脂混合载体与酶液体积比为2:1时固定化酶表现出的转化率最高;得到的固定化酶最适反应温度为40℃;最适反应pH值为5.4;最适底物质量浓度为5g/100mL蔗糖;35℃保温1h后剩余酶活力为原来的44%,固定化酶比游离酶的热稳定性好;固定化酶的动力学常数Km=0.02835mol/L。

右旋糖酐蔗糖酶生产菌的产酶条件研究

右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为底物,催化转移D-葡萄糖基生成α-葡聚糖或低聚糖的葡萄糖基转移酶。本实验对右旋糖酐蔗糖酶生产菌的产酶条件进行了研究。结果表明:诱导产酶碳源为5%蔗糖、培养时间24h、培养温度25℃、培养液初始pH值8.0为最佳产酶条件。

重组大肠杆菌产右旋糖酐蔗糖酶的培养基优化

研究了培养基中葡萄糖、酵母浸膏、Ca2+浓度及无机离子类型等对重组大肠杆菌产右旋糖酐蔗糖酶的酶活力影响。在优化的培养基条件下,右旋糖酐蔗糖酶酶活力达26.6u/ml。使用该重组酶催化制备右旋糖酐,在8h内底物转化率达82%,右旋糖酐分子量高于355k。

右旋糖酐蔗糖酶酶学性质研究

肠膜状明串珠菌Lm-1226发酵产右旋糖酐蔗糖酶,发酵液经过硫酸铵盐析分离提取右旋糖酐蔗糖酶,进行酶学性质研究。首先进行Lm-1226发酵产右旋糖酐蔗糖酶产酶进程研究,28h酶活力最高。盐析分离提取右旋糖酐蔗糖酶,硫酸铵饱和度15%时酶活力最高。酶学性质研究,右旋糖酐蔗糖酶作用的最适pH和温度分别为pH5.4和30~35℃;在55℃以下相对稳定,在pH4.6~p H8.0范围内相对稳定,具有较好的酸碱稳定性;。Mn2+具有显著的激活作用,对酶具有较强抑制作用。

IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达

研究异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达的效果。在利用IPTG和乳糖分别作为诱导剂对右旋糖酐蔗糖酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET28-dexYG进行诱导表达的基础上,尝试将此两种诱导剂联合使用,在降低成本的同时获得较好的表达效果。在获得最佳培养基的基础上,考察菌体IPTG与乳糖的联合加入量、菌体浓度、诱导时间对右旋糖酐蔗糖酶表达的影响。在菌浓(OD600 nm)达到3.0时,加入0.1 mmol/L IPTG 95μL+2.5 g/L乳糖,25℃混合诱导培养4 h,酶活力最高,达到40.44 U/mL。IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达可行。

右旋糖酐蔗糖酶纯化及生产应用的研究进展

右旋糖酐蔗糖酶是一种主要由肠膜明串珠菌分泌获得,能以蔗糖为底物合成右旋糖酐的葡萄糖基转移酶。在右旋糖酐的合成中,酶合成法相比菌种发酵法具有高效连续生产、产物易分离等优点,因此对右旋糖酐蔗糖酶的深入研究将有助于提升酶法合成右旋糖酐、低聚糖等产物的效率和可行性。文章以右旋糖酐蔗糖酶为中心点,综述了其催化机理、纯化方法、生产改造和应用研究进展,并阐述了基因工程、双酶联用等技术对该酶功能的优化,最后针对目前仍存在的问题及未来的研究方向进行了总结。

基于右旋糖酐蔗糖酶转糖基作用的槲皮素葡萄糖苷的合成研究

右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为唯一底物,将蔗糖分子中D-葡萄糖基催化转移到受体分子上的葡萄糖基转移酶。利用右旋糖酐蔗糖酶的转糖基作用,以蔗糖为葡萄糖糖基供体,槲皮素为糖基受体,对槲皮素糖苷的酶法合成进行了探索。通过对该酶催化反应体系、催化反应条件及产物分析的研究,结果表明:在25°C下,右旋糖酐蔗糖酶能够在30%DMSO-70%乙酸-乙酸钙(0.02 mol/L,pH值5.4)的反应体系中催化合成一种槲皮素葡萄糖苷,在这个反应体系下,以10%的蔗糖作为糖基供体,槲皮素为糖基受体,右旋糖酐蔗糖酶活力为40 U/mL,转速为150 r/min,槲皮素糖苷的转化率最高,可达39.5%。通过质谱分析确定是一种槲皮素单糖苷,分子量为464。该研究结果为黄酮类物质的糖基化修饰奠定了基础。

右旋糖酐蔗糖酶及其分子改造

右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为底物合成右旋糖酐的聚合酶。该酶及其催化产物在医药、食品、化工等工业领域具有重要的应用价值与广泛的工业用途,因此近年来对右旋糖酐蔗糖酶的研究逐渐增多。本文结合文献及本实验室研究成果,对右旋糖酐蔗糖酶的研究进展及其工业应用进行综述,并对当前有关该酶研究的热点和重点以及未来的研究趋势提出了见解。

单酶法合成低分子量右旋糖酐的研究进展

低分子量右旋糖酐(Dextran)是以蔗糖为底物,由右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase, DSR)催化合成葡萄糖聚合物后,再经酸水解/酶水解形成的化合物,其分子量为10 000-20 000 Da,可广泛应用于医药、食品等行业。本文综述了单酶法合成右旋糖酐的研究进展,包括微生物法/酶法生产右旋糖酐的优缺点,DSR的高效表达,单酶法合成右旋糖酐的过程调控,DSR的固定化技术、结构和催化机理,以及单酶法合成低分子量右旋糖酐的研究现状,并在此基础上提出DSR单酶一步法直接合成低分子量右旋糖酐的思路。借助人工智能技术可获得更详细的DSR结构信息,在进一步解析DSR的结构、功能和催化机理的基础上,对其进行合理的设计和改进,优化酶学性质,实现单酶一步法直接合成低分子量右旋糖酐,可为生产低分子量右旋糖酐提供了新的理论支持。

重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶的表达条件优化

通过设计正交实验,考察了培养基中各组分及其浓度对右旋糖酐蔗糖酶工程菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET28-dexYG诱导产酶结果的影响。在获得最佳培养条件的基础上,考察温度、蔗糖浓度和pH值对右旋糖酐产量的影响。结果表明:菌浓OD600达到2.0时,加入异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷(IPTG)至0.25mmol/L,25°C诱导培养4h,产酶活力最高,达到110.16U/mL,蔗糖浓度对产量的影响比较显著。研究结果得到高效表达的培养条件,为实现该酶的工业化应用打下了基础。

肠膜明串珠菌产右旋糖酐蔗糖酶条件优化

右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为底物,催化转移D-葡萄糖基生成α-葡聚糖或低聚糖的葡萄糖基转移酶。对肠膜明串珠菌的产酶发酵条件进行了优化,通过正交实验得出该菌的最优产酶条件为蔗糖5 g/100 mL、牛肉膏2 g/100 mL、酵母膏1.25 g/100 mL、pH7.0。采用多级中空纤维超滤膜对粗酶液进行浓缩,使粗酶液酶活由2.31 U/mL提高到了8.78 U/mL,为酶法定向合成右旋糖酐奠定基础。

酶法合成右旋糖酐及过程调控研究进展

右旋糖酐是一种应用于食品和医药行业的微生物多糖。文中从机理研究、生产菌株和酶的筛选及优化、生产条件控制等方面综述了酶法合成右旋糖酐的最新研究进展,指出酶法合成右旋糖酐仍存在机理不明和产物品质有待提高的问题,而优化固定化技术和开发新菌种以利用葡萄糖代替蔗糖为底物合成右旋糖酐将是右旋糖酐研究的一个新方向。

酶法合成右旋糖酐相对分子质量的控制

用海藻酸盐固定的肠膜状明串珠菌所产右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐，在合成过程中加入右旋糖酐酶，使超高相对分子质量的右旋糖酐裂解，以调节产物的相对分子质量；用凝胶渗透色谱（GPC）作为表征手段，对右旋糖酐相对分子质量与右旋糖酐酶的添加量及反应时间的关系等进行了研究。结果表明，右旋糖酐酶在最初的2h就能使右旋糖酐的重均相对分子质量从8．52×10^5降至2．00×10^5，随后作用减缓；右旋糖酐的重均相对分子质量随右旋糖酐酶用量的增加而减小，并且酶用量对产物相对分子质量的影响是非线性的；右旋糖酐蔗糖酶与右旋糖酐同时进入反应体系所得右旋糖酐的收率最高可达86．8％。在100mL蔗糖质量浓度为100g／L的底物溶液中，加入15u右旋糖酐蔗糖酶液，同时加入0．19～0．75U右旋糖酐酶，反应24h，可以得到相对分子质量为1．0×10^5～2．0×10^4的右旋糖酐。

酶法合成右旋糖酐的研究

利用肠膜状明串珠菌(Leuconstoc mesenteriodes)右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖合成右旋糖酐。分别探讨了不同蔗糖浓度、加酶量、反应温度、pH值和反应时间等因素对蔗糖转化率的影响,从中选取影响较显著的3个因素如蔗糖浓度、反应温度、pH值,采用均匀设计试验方法对酶促反应条件进一步优化,确定酶促反应最佳工艺参数。实验结果表明:酶法合成右旋糖酐的最佳条件为:蔗糖浓度50g/L,加酶量为0.214U,反应温度12℃,pH值为7.5,反应时间为30h,蔗糖转化率约为31%。

酶法合成右旋糖酐过程规律的研究

右旋糖酐蔗糖酶可催化蔗糖产生D-葡萄糖基,并将其转移到糖链上聚合形成不同分子量的右旋糖酐,应用于食品、医药和化工等行业。区别于菌发酵,酶法合成右旋糖酐具有高效、绿色、反应体系简单等优点。文章通过构建单酶和双酶体系,探索右旋糖酐蔗糖酶及协同右旋糖酐酶催化蔗糖制备右旋糖酐的过程规律。结果表明:在单酶体系条件下,产物右旋糖酐分子量均处于百万级别以上;同时引入右旋糖酐酶构建双酶体系,反应趋向于合成低聚右旋糖酐;随着右旋糖酐酶加入时间的延长,中等分子量片段(10~5 Da<Mw<10~6 Da)和大分子量片段(Mw>10~6 Da)右旋糖酐所占比例越大,而低分子量片段(10~4 Da<Mw<10~5 Da)右旋糖酐所占比例降低;且当蔗糖浓度一定时,整体上右旋糖酐分子量随着双酶酶活比的增大而减小,通过调控双酶酶活比可以制备不同分子量的右旋糖酐产品,为其在不同领域的应用提供了坚实的理论基础。

Mn^(2+)对DNS法测定右旋糖酐发酵液中果糖含量的影响

在Mn^(2+)对肠膜状明串珠菌发酵产右旋糖酐的影响研究中出现的果糖和右旋糖酐随Mn^(2+)浓度变化的不一致而发现问题;随后通过Mn^(2+)对右旋糖酐蔗糖酶作用的影响研究中找出了DNS测定果糖是产生问题的原因;然后通过Mn^(2+)与DNS的发应进一步证实,Mn^(2+)本身的氧化还原型性导致其与DNS试剂产生反应而影响了果糖的测定;最后通过检测时以含有Mn^(2+)的培养基作为相对应发酵液的空白对照,检测结果表明果糖和右旋糖酐随Mn^(2+)浓度变化一致,但是同一发酵液样品中果糖含量和右旋糖酐含量的多少还存在问题,说明仅仅通过改变检测空白还不能消除Mn^2对果糖检测的影响,还需要进一步的研究。在利用DNS法测定样品中的还原糖时,一定要考虑具有氧化还原性的其他成分对检测结果的影响。

D-果糖的酶法制备及其结晶条件的研究

[目的]提高由酶法制备的果糖在水-乙醇体系下的结晶收率。[方法]利用右旋糖酐蔗糖酶催化制备右旋糖酐,剩余的废液经纯化精制后得到可以进行结晶操作的果糖溶液,并通过单因素试验对果糖在水-乙醇结晶体系的结晶条件进行了研究,结晶方法为冷却降温结晶。最后对结晶产品进行了高效液相色谱、中红外光谱及元素分析检测。[结果]在水-乙醇比例为1∶4的体系下果糖的纯度在90%以上,母液的白利度为85 Brix°,固形物总质量10%的晶种用量,养晶9 h的条件下的结晶收率最大,达到60.51%,检测证实结晶产物为果糖。[结论]该方法对提高果糖在水-乙醇体系下的结晶收率及其酶法制备具有重要的参考价值。

低温生产高活性右旋糖苷蔗糖酶的明串珠菌的筛选

明串珠菌是异型发酵乳酸菌的一种,主要作用于蔬菜发酵食品的发酵初期,能够代谢生成CO2和多种风味化合物,是占有重要地位的发酵剂菌种之一。明串珠菌在蔗糖诱导下分泌右旋糖酐蔗糖酶,此酶分解蔗糖生成的葡萄糖基,转移到异麦芽糖等受体中生成低聚糖。为了提高蔬菜发酵食品中低聚糖生成量,实验从蔬菜发酵食品中筛选了低温生产高活性右旋糖酐蔗糖酶的明串珠菌,随后对分离菌株进行了鉴定及发酵特性研究。结果所筛选4个菌株均为肠膜明串珠菌,在低温下显示了很高的右旋糖酐蔗糖酶活性。这些明串珠菌菌株应用到发酵食品将会有助于提高发酵食品的感官质量和功能性。