基于转录组学探讨右旋龙脑对顺铂耐药非小细胞肺癌的增敏作用及机制

目的采用转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)技术挖掘右旋龙脑联合顺铂对顺铂耐药的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞的作用关键靶点,并验证其机制。方法将顺铂耐药的人大细胞肺癌细胞(H460/CDDP)接种于4周龄雄性BALB/c裸鼠右侧腋下,构建异种移植肿瘤模型,将其分为对照组、溶剂组、顺铂组、联用组(右旋龙脑+顺铂),每组6只,药物干预14 d。末次给药24 h后,取肿瘤组织,转录组测序;实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化法(IHC)检测细胞周期相关分子表达。结果顺铂组与联用组在基因表达水平存在差异,且明显富集于细胞周期。RT-PCR和IHC结果显示,右旋龙脑联合顺铂组能明显抑制细胞周期蛋白(CCNA2,CCND3)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2,CDK6)的表达量,并促进其上游分子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDKI(P21,P27)的表达(P<0.05,P<0.01)。结论右旋龙脑联合顺铂通过上调P21、P27表达,抑制cyclinA2/D3及CDK2/6表达,诱导细胞周期阻滞,抑制H460/CDDP细胞的恶性增殖,进而达到抗耐药增敏的作用。

基于转录组数据挖掘阴香右旋龙脑生物合成相关基因

右旋龙脑又名天然冰片,是珍贵的传统中药材和高级香料,具有抗菌、消炎、促进药物透过血脑屏障等作用。为阐明右旋龙脑的生物合成途径,收集了2种化学型的阴香,利用Illumina Novaseq测序平台进行转录组测序,使用Trinity软件对Clean reads进行组装,共获得40449条Unigene,N 50长度为1679 bp,Q 30质量值均在92%以上,说明测序质量较好,可用于后续分析。分别有23613(58.38%)、21743(53.75%)、16372(40.48%)、15384(38.03%)、17993(44.48%)、19753(48.83%)个基因在NR、eggNOG、Swiss-Prot、KEGG、Pfam、GO数据库获得注释。KEGG富集分析表明,柠檬烯和蒎烯降解、二苯醚类、二芳庚烷类和姜辣素生物合成被富集,类黄酮生物合成、苯基丙烷生物合成、二萜生物合成等次生代谢物质的合成通路也被富集。GO分析发现,生物学过程类别主要集中在生物过程、转录,DNA模板化;细胞组分类别主要涉及细胞核、细胞质、质膜等细胞组分;分子功能类别主要集中在分子功能、蛋白质结合和序列特异性DNA结合。鉴定出参与右旋龙脑生物合成相关酶基因38个,包括35个参与萜类骨架生物合成有关的酶基因,3个单萜合酶基因,其中MEP途径可能编码5种酶的7个基因和MVA途径可能编码4种酶的7个基因表达量上调。此外与单萜生物合成相关的5个转录因子(bHLH家族2个、MYB家族1个、bZIP家族1个)显著上调。

阴香叶片精油中右旋龙脑含量近红外预测模型构建研究

为建立阴香Cinnamomum burmannii叶片中精油右旋龙脑含量的近红外光谱预测模型,使用波通(PERTEN)公司的DA7250近红外光谱分析仪,在950~1650 nm的光谱范围内,分析了76个阴香叶片样本的光谱数据,经过光谱预处理,并比较选择最佳预处理方法、最佳光谱波段范围和最佳主成分数,采用偏最小二乘法(PLS)建立阴香叶片精油中右旋龙脑含量近红外光谱模型。结果表明:采用一阶导数-标准正态变量转换法(FD-SNV)对光谱进行预处理且当最佳主成分数为16时,得到最优模型,其校正集均方根误差(RMSEC)为7.4071,校正集相关系数(R_(C))为0.9314,交互验证集均方根误差(RMSEV)为13.4822,交互验证集相关系数(R_(V))为0.7759。说明预测值与测量值具有显著的相关性,该预测模型具有一定的准确性,可以用于阴香叶片精油中右旋龙脑含量进行快速预测。

冰片中右旋龙脑及其异构体的手性毛细管气相色谱法测定

以CYDEX -B手性毛细管柱 (25m×0.22mm,0.25μm)作为分析柱,用气相色谱法和气相色谱 -质谱联用法对天然冰片、艾片和合成冰片进行测定。合成冰片中的左旋龙脑与右旋龙脑可完全分离 ,左旋异龙脑与右旋异龙脑可部分分离。实验测得 :天然冰片中右旋龙脑的含量为99.13%～99.61 %;艾片中左旋龙脑的含量为95.87 %;合成冰片中左旋龙脑的含量为31.44 %～54.57 %,右旋龙脑的含量6.87 %～25.37 %;合成冰片的比旋度 α30D 为 -17.3°～ -2.3°。

梅片树中高纯度右旋龙脑制备及其性质表征

通过水蒸气蒸馏法从梅片树叶中提取挥发油,冷冻、离心得粗右旋龙脑,用石油醚、120号汽油和无水乙醇分别进行重结晶,得到高纯度右旋龙脑晶体,并对晶体的成分、旋光性、形态和热性能进行了表征。结果表明,梅片树树叶挥发油中右旋龙脑含量为68.10%;重结晶后纯度达98%以上,质谱图分析结果和标准品基本一致,旋光度也相近;石油醚和120号汽油重结晶晶体呈规则六边形大片状,边界清晰,无水乙醇重结晶晶体形状不规则,呈分散或团聚的小颗粒状,但两者的热分析结果基本相同,说明重结晶晶体形貌不影响其热性能。右旋龙脑晶体非等温结晶过程中,莫志深方程能很好地描述右旋龙脑的非等温结晶动力学。本实验结果可为梅片树的综合利用及高纯度天然右旋龙脑新资源的研究开发提供参考。

梅片树叶挥发油和天然右旋龙脑的抑菌性能研究

目的:研究梅片树叶挥发油、天然右旋龙脑的体外抗菌性能。方法:采用K-B纸片琼脂扩散法测定梅片树叶挥发油、天然右旋龙脑和合成龙脑对细菌、植物病原真菌和动物源真菌的抑菌圈大小,并采用琼脂稀释法测定其最小抑菌浓度(MIC值)。结果:梅片树叶挥发油、天然右旋龙脑和合成龙脑有不同程度的抑菌作用,天然右旋龙脑和合成龙脑抑菌作用相似,梅片树叶挥发油的抑菌效果比较明显。结论:梅片树叶挥发油和天然右旋龙脑均有一定的抑菌活性,具有广阔的开发利用前景。

樟脑手性合成右旋龙脑

根据氢化铝锂的强还原性和联萘酚的不对称选择性,用右旋联萘酚改性过的氢化铝锂为手性试剂,把樟脑还原成右旋龙脑.研究手性试剂用量、反应时间、反应温度、溶剂极性等各种因素对转化率,以及相对旋光度的影响.结果表明,在手性试剂与樟脑的摩尔比为2.57、反应温度为25℃、反应时间为4 h、溶剂为无水乙醚条件下,得到转化率为82.40%、产率为24.55%、相对旋光度为69.2%的右旋产物.

高纯度天然右旋龙脑的制备研究

以樟树[Cinnamomumglanduliferum(Wall)Nees]枝叶为原料经水蒸气蒸馏、升华得到70%～80%粗d 龙脑。为制备高纯度天然d 龙脑,进行了不同溶剂、不同溶剂量、结晶次数和结晶时间对d 龙脑纯度影响的研究。并用GC、GC/MS分析鉴定所制备的天然d 龙脑,用扫描电子显微镜观察d 龙脑结晶过程中晶体的结构变化。结果表明,汽油是结晶d 龙脑最好的溶剂,当物料比为1∶1.7～2.0、结晶时间4d以上时,天然d 龙脑的纯度可达99%以上。精制天然d 龙脑产品的分析数据为:外观白色片状结晶,右旋龙脑含量>99%,旋光度[α]20D>+37°,熔点205～209℃,重金属<5×10-6,砷(As)<2×10-6。

安宫牛黄丸中麝香酮和右旋龙脑含量测定

目的:利用气相色谱法建立安宫牛黄丸中麝香酮和右旋龙脑的含量测定方法。方法:采用气相色谱法。以:HP-5(Agilent Technologies)(30 m×320μm×0.25μm)为色谱柱;载气为氮气,流速7 mL/min,空气流速320 mL/min,氢气流速为70 mL/min,氮气为尾吹气,流速30 mL/min;分流进样。结果:安宫牛黄丸中麝香酮和右旋龙脑的含量分别为0.09 g/mg、0.25 g/mg。结论:该方法准确、灵敏度高、重现性好,可以作为安宫牛黄丸中麝香酮和右旋龙脑的含量测定方法。

碱金属/THF体系不对称还原樟脑制备右旋龙脑

利用樟脑还原中间产物的分子热力学稳定性差异,在碱金属/THF(四氢呋喃)体系中进行樟脑的不对称还原研究,考察碱金属用量、溶剂用量、反应时间和反应温度对反应的影响.结果表明,最优反应条件为碱金属与樟脑的量比为2.8,溶剂用量与樟脑的量比为22.5,反应时间为3 h,反应温度为25℃.在此条件下,反应所得樟脑转化率为93%,右旋龙脑产率为72%.

超声强化水蒸气蒸馏法提取天然右旋龙脑

利用实验室自主研制的超声强化水蒸气蒸馏装置从梅片树叶中提取天然右旋龙脑,气相色谱法测定右旋龙脑的含量。结果表明:超声波能有效强化水蒸气蒸馏效果,其最佳工艺参数是:超声电功率400W,超声作用时间1h,投料比为0.2kg/L。在此条件下,挥发油得率可达到1.18%,右旋龙脑的纯度达到60.6%。

天然脑粉不对称还原制右旋龙脑

利用樟脑还原中间产物的分子热力学稳定性的差异,在还原体系还原剂S/无水乙醇中进行樟脑的不对称还原,考察还原剂用量、溶剂用量和反应温度对反应的影响.结果表明,最佳反应条件为还原剂S与樟脑量的比为2.8,溶剂用量为15.5,反应时间为40 min,利用这种方法还原樟脑,主产物为右旋龙脑,副产物为异龙脑,两者的比例几乎固定不变.研究还表明,在该体系中还原樟脑,反应温度易于控制,反应条件比较温和,反应产物收率较高,反应所得樟脑最高转化率为78%,右旋龙脑最高产率为66%.

羟丙基-β-环糊精包合对右旋龙脑性质的影响

采用超声法制备了右旋龙脑/羟丙基-β-环糊精包合物,并用差示扫描量热法和X-射线衍射法鉴定,然后采用气相色谱法,以右旋龙脑含量为指标,分别对包合物进行挥发性、热稳定性、抗光解性和相溶解度实验.结果表明:在常温、光和热的因素影响下,包合物中右旋龙脑的含量明显高于混合物,这表明包合物具有一定的抗光解性和热稳定性,其稳定性明显优于单纯的右旋龙脑,便于长久贮存而不改变疗效;羟丙基-β-环糊精浓度为0～8 mol/L时,右旋龙脑的浓度随着羟丙基-β-环糊精浓度的增加而增加,表明右旋龙脑形成包合物后,其溶解性得到了显著提高.

樟脑不对称还原制备右旋龙脑小试

通过均匀设计,分别在3 L和5 L的烧瓶中,进行碱金属/无水乙醇体系还原樟脑工艺的放大实验.结果表明:放大后所得的樟脑转化率和龙脑产率比均匀实验时有所降低,但经过二次还原,反应体系趋于稳定.合成龙脑工艺放大后仍然可行,右旋龙脑的最高收率分别达到81.13%和80.58%.红外吸收光谱证实,反应产物为右旋龙脑.

右旋龙脑的应用及生产方法

介绍天然右旋龙脑的应用,并重点介绍从植物中提取右旋龙脑的进展,讨论了化学法和生物法合成生产右旋龙脑的可行性。

正交实验优选羟丙基-β-环糊精对右旋龙脑的增溶条件

目的探讨羟丙基-β-环糊精对右旋龙脑溶解度的影响。方法采用气相色谱法测定右旋龙脑含量,设计L16(45)正交实验优选超声时间、羟丙基-β-环糊精浓度、温度、搅拌时间对右旋龙脑溶解度的影响。结果超声时间为60 min,羟丙基-β-环糊精浓度25%,温度25℃,搅拌时间8 h,右旋龙脑溶解度为59.80 mg·m L-1。结论羟丙基-β-环糊精对右旋龙脑溶解度有很大的提高。

天然脑粉二次还原精制右旋龙脑

根据化学平衡理论，提出了还原剂A／无水乙醇体系二次还原精制龙脑的工艺，并且考察了还原剂A用量和溶剂用量对樟脑二次还原的影响。经二次还原，樟脑转化率及龙脑产率都得到了较大提高。在本文的最佳反应条件下，还原剂A／无水乙醇体系二次还原所得的最高樟脑转化率和龙脑产率分别为93％和81％。二次还原法具有反应时间短，反应条件温和，产物收率和产物纯度高，经济效益高，绿色环保等优点。

气相色谱法同时测定龙脑樟鲜叶中右旋龙脑、樟脑及乙酸龙脑酯的含量

建立了气相色谱法同时测定龙脑樟鲜叶中右旋龙脑、樟脑及乙酸龙脑酯含量的方法。采用水蒸气蒸馏法提取龙脑樟鲜叶中的天然冰片,硅胶柱层析法精制天然冰片粗品,GC法测定其中右旋龙脑、樟脑及乙酸龙脑酯的含量。色谱条件:色谱柱为DB-5MS(30.00 m×250.00μm×0.25μm),进样量1μL,柱温从90℃开始程序升温,流速1 mL/min,进样口温度280℃。右旋龙脑、樟脑及乙酸龙脑酯的回归方程分别为y=3.4462x-7.4057(r=0.9998);y=3.4881x-0.0026(r=0.9999);y=2.8657x-0.0914(r=1.0000),表明三者分别在99.14~991.37μg/mL、1.92~19.18μg/mL及2.01~20.01μg/mL范围内线性关系良好。三者的平均回收率分别为100.86%、98.36%和101.66%,相对标准偏差(RSD)分别为1.94%、2.88%和2.18%。从龙脑樟鲜叶中提取纯化后的天然冰片中右旋龙脑质量分数均在98.45%以上,樟脑及乙酸龙脑酯质量分数较低,不含异龙脑,说明龙脑樟鲜叶质量较佳。该法操作简便、准确、精密度高、分离度好,分析时间短,可为龙脑樟药材的质量控制提供参考。

GC法测定天然冰片(右旋龙脑)中杂质樟脑的含量

目的建立GC法测定天然冰片（右旋龙脑）中杂质樟脑的含量。方法以聚乙二醇（PEG）为固定相;柱温为170℃。结果在0.11mg.mL-1范围内线性关系良好,r=0.999,平均回收率为99.7%,RSD为1.6%（n=6）。结论本方法简便、灵敏、重复性好,可用于冰片中的樟脑的质量控制。

毛细管气相色谱法测定天然冰片遗留物中右旋龙脑的含量

采用气相色谱方法HP-5规格(30m×0.32mm0.25μm)石英弹性毛细管柱,进样口温度200℃、氢火焰检测器(FID)220℃、程序升温,初始温度70℃,以3℃/min升到120℃,保持5min,在此色谱条件下,右旋龙脑峰与其他峰能有效分离。经重复试验,测得遗留物中的右旋龙脑在67%～70%。